<正>流感病毒是一种分节段的、有囊膜包裹的负链RNA病毒,属于正黏病毒科。根据其内部NP和M的不同,分为A、B、C三型[1]。到目前为止,禽流感(avian influenza,AI)只由A型流感病毒引起,B、C型流感病毒尚未在禽类体内发现。自然界中,A型流感病毒的宿主范围相当广泛,猪、马、虎、水貂、狐狸、猫、鲸、禽类以及人体内都分离到A型流感病毒,是人畜共患的重要呼吸道疾病病原,具有特殊的重要性。

关键词：流感病毒；负链；avian；呼吸道疾病；病毒基因组；正黏病毒科；流行毒株；宿主范围；野生水禽；介导病毒

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【目的】寻找与新陆早棉花品种农艺和纤维品质性状相关联的分子标记,鉴别与这些性状相关的优异等位变异及携带优异等位变异基因的典型载体材料,为新陆早棉花品种分子设计育种奠定基础。【方法】利用筛选出分布于26条染色体且多态性高的75对SSR标记对51份新陆早棉花品种进行多态性扫描;采用R语言编程软件对多环境的表型性状绘制boxplot图;在对供试材料进行群体结构和连锁不平衡分析的基础上,利用TASSEL软件中MLM(mixed linear model)方法进行分子标记与15个性状的关联分析;依据计算的表型效应值,鉴别和统计优异等位变异的位点及典型材料。【结果】通过群体遗传结构分析将51份新陆早棉花品种划分为4个亚群结构。针对15个表现型性状的BLUP(best linear unbiased prediction)结果进行统计和分析,鉴别出极显著和显著相关的性状。分析结果显示,在4种环境条件下,棉花5个性状(果枝始节高、果枝始节数、衣分、纤维上半部长度和短纤维率)变化趋势稳定,10个性状(株高、果枝数、叶枝数、有效铃数、单铃籽棉重、单铃皮棉重、马克隆值、比强度、纤维整齐度和纤维伸长率)较稳定。通过关联分析,获得与农艺性状相关的等位变异位点117个(P<0.05),其中对9个农艺性状贡献率(R2)最大的等位变异位点分别为:BNL3650b(株高,R 2=11.78;果枝始节高,R 2=20.80;果枝始节数,R 2=11.54)、NAU3995c(果枝数,R2=14.86)、BNL119b(叶枝数,R2=9.7)、NAU3995d(有效铃数,R 2=14.98)、BNL3255a(单铃籽棉重,R 2=11.11)、NAU1071a(单铃皮棉重,R 2=10.15)和BNL663a(衣分,R2=12.42)。与纤维品质相关的等位变异位点55个(P<0.05),其中分别对6个纤维品质性状贡献率最大的等位变异位点为:NAU1103b(纤维上半部长度,R 2=6.4)、NAU1071a(纤维比强度,R 2=7.57)、BNL3140b(马克隆值,R 2=12.06)、BNL3650b(纤维整齐度,R 2=13.47)、BNL1421a(短纤维率,R 2=13.04)和BNL2960b(纤维伸长率,R 2=11.67)。共检测到39个与农艺(29个)和纤维品质(10个)性状相关的位点(P<0.01),对表型变异解释率范围为6.45%—20.8%,平均值为11.14%,同时检测到与2个以上性状相关联的位点47个。携带优异等位变异基因的典型材料共计17份。通过与已经报道的棉花农艺和纤维品质性状相关的QTL(quantitative trait loci)比较,检测的27个QTL在前人研究中已经报道,其中BNL3650(纤维整齐度)、BNL3033(马克隆值)、NAU3254(纤维伸长率)、GH132(衣分)、TMB1618(比强度)、BNL1421(比强度和纤维整齐度)和BNL119(纤维伸长率)7个QTL具有相同的关联性状。【结论】51份原种新陆早棉花品种的群体遗传结构简单,连锁不平衡水平低,表型性状在2种环境条件下变化趋势较稳定。基于SSR的关联分析,发掘了一些与农艺和纤维品质相关的优异等位变异基因及典型材料。

关键词：新陆早棉花品种；农艺性状；纤维品质；群体结构；关联分析；等位变异

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【目的】NAC转录因子是植物特有的一类转录因子,N端含有一段高度保守、约150个氨基酸组成的NAC结构域,而C端为高度变异的转录调控区。NAC转录因子不仅参与植物生长发育的调控,而且在植物抗逆反应中具有重要的调控作用。作者从紫花苜蓿中克隆了一个NAC类转录因子基因Ms NAC2,期望通过分析其DNA和氨基酸序列特征,阐明其在紫花苜蓿中响应非生物胁迫的表达模式,通过在烟草中过量表达鉴定其生物学功能,为进一步了解Ms NAC2在紫花苜蓿中的耐逆调控机理提供试验基础,并为通过转基因技术改善紫花苜蓿抗逆力和提高其品质奠定研究基础。【方法】应用RT-PCR和RACE技术获得紫花苜蓿Ms NAC2全长序列,并进行生物信息学分析。应用real-time PCR技术分析该基因在非生物胁迫下的时空表达特征。构建Ms NAC2-GFP融合表达载体,进行基因表达的亚细胞定位分析。同时构建p BI121-Ms NAC2植物超表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草叶盘,比较逆境胁迫条件下野生型烟草和转基因株系的表型和生理指标,鉴定超表达Ms NAC2对烟草耐逆能力的调控效应。【结果】Ms NAC2全长1 358 bp,开放阅读框长度为1 023 bp,编码340个氨基酸,编码蛋白质分子量为39.4 k D,其N端含有典型的NAC保守结构域,C端高度变异。进化树聚类分析表明,该基因与脐橙Cs NAC亲缘关系较近,属于NAC蛋白的ATAF亚家族。洋葱亚细胞定位分析表明Ms NAC2定位于细胞核。转录水平表达分析表明Ms NAC2受250 mmol·L-1Na Cl、20%PEG6000、0.1 mmol·L-1 ABA和4℃胁迫诱导而显著升高,并且Ms NAC2在根中的表达量要明显高于在叶中的表达量。抗性试验结果显示,在Na Cl、PEG和4℃冷害胁迫下,转基因烟草苗高、根长、鲜重和干重等生长指标均高于野生型。生理指标检测结果表明,在250 mmol·L-1 Na Cl、20%PEG6000和4℃处理24 h后,转基因烟草叶片丙二醛含量明显低于野生型烟草,分别为野生型的82.6%、73.2%和77.8%。脯氨酸含量高于野生型烟草,分别达1.52倍、1.72倍和2.24倍,且SOD和POD的活性均高于野生型烟草,分别为野生型的1.101倍、1.105倍、1.33倍和1.12倍、1.08倍及1.19倍。【结论】从紫花苜蓿中克隆了一个新的NAC转录因子基因Ms NAC2,该基因能够对盐、冷害和干旱胁迫产生响应,与野生型烟草相比,过量表达Ms NAC2烟草具有较强的耐盐、抗旱和抵御寒冷的能力,说明该基因可能参与调控非生物逆境胁迫的生理响应。

关键词：紫花苜蓿；Ms NAC2；基因克隆；功能分析

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【目的】球孢白僵菌(Beauveria bassiana)作为一种重要的虫生真菌,已广泛应用于害虫生物防治,但其不成熟的规模化生产技术一直是限制球孢白僵菌广泛应用的主要问题之一。开展球孢白僵菌液体发酵工艺研究,提高液体发酵生物量,从而为固体发酵阶段提供优质的种子液,进而提高固体发酵的产孢量,为球孢白僵菌规模化生产提供参考。【方法】影响球孢白僵菌液体发酵的培养条件有温度、装样量、摇床转速、接种浓度和p H等,首先采用Plackett-Burman试验设计,筛选出影响球孢白僵菌菌株SDDZ-9的液体发酵的主要因子,然后运用最陡爬坡路径法,以试验值变化的梯度方向和各因素效应值的大小分别确定爬坡方向和变化步长,确定响应面的中心点,逼近最佳值区域,最后采用central composite design(CCD)响应曲面法,建立多元二次回归方程来拟合各因素与效应值之间的关系,并对影响发酵生物量的各因素及其交互作用进行响应面分析和评价,确定对西花蓟马(Frankliniella occidentalis)毒力较高的球孢白僵菌菌株SDDZ-9液体发酵的最优培养条件。【结果】培养温度、装样量、转速和浓度是影响发酵生物量的主要因子,一定范围内的p H变化对此菌株的液体发酵影响较小。在自然p H下,当培养温度27.08℃、装样49.72 m L(250 m L三角瓶)、摇床转速205.45 r/min、接种浓度1.122×107孢子/m L时,发酵48 h产生的生物量最大。在优化发酵条件下进行液固双相发酵试验,得到的球孢白僵菌液体发酵生物量为14.769 g·L-1,与模型预测生物量相符,固体发酵后产孢量为20.16 g·kg-1,含孢量1.84×1011孢子/g。【结论】在优化发酵工艺条件下进行发酵,可显著提高球孢白僵菌的产孢量,此液体发酵工艺为球孢白僵菌的规模化生产奠定了基础。

关键词：球孢白僵菌；响应曲面法；发酵条件；优化

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 【目的】土壤易分解氮(labile nitrogen,Lab-N)和耐分解氮(recalcitrant nitrogen,Rec-N)是土壤氮库的两个重要组分,其组分含量与比例可反映土壤有机氮周转与固存特性。因此,研究土壤长期不同施肥制度下易分解氮与耐分解氮的含量及比例特性,是土壤氮库管理与土壤肥力质量建设的重要研究内容。【方法】利用中国东部3种旱作土样(吉林公主岭黑土、河南郑州潮土、湖南祁阳红壤)和1种水稻土土样(湖南望城),运用颗粒密度分组法,研究长期不施肥(CK)、施化肥(NPK)、化肥配施秸秆(NPKS)和化肥配施有机肥(NPKM)4种不同施肥制度下易分解氮和耐分解氮的含量及比例变化特征。【结果】旱作土壤易分解氮的平均含量为0.15g·kg-1(0.10—0.29 g·kg-1)低于水田的0.22 g·kg-1(0.20—0.23 g·kg-1),而其占全氮的比例高于水田。经23年处理后,旱作土壤CK处理全氮含量较试验初期氮含量显著下降,下降的比例为7.5%—9.7%,水稻土则显著上升,升高的比例为11.5%;长期NPK处理,旱作土壤和水田全氮含量较CK显著增加,红壤易分解氮含量较CK易分解氮显著下降,其他地点无显著变化;长期NPKS处理,旱作和水田土壤全氮含量显著增加,黑土和水稻土易分解氮含量及其占全氮的比例较CK无显著变化,红壤易分解氮含量显著下降,而潮土易分解氮含量显著增加;长期NPKM处理,显著提高了旱作土壤全氮含量、易分解氮含量及易分解氮占全氮的比例,其中黑土增加的比例最大分别为85.0%、106.0%和4.2%,水稻土易分解氮含量及其占全氮的比例无显著差异性。4种土壤耐分解氮的含量与全氮含量的变化趋势一致,均表现为NPKM>NPKS>NPK>CK,其中NPKM处理降低了耐分解氮占全氮的比例。【结论】旱作土壤易分解氮含量及其占全氮的比例对不同施肥处理的响应比水田更加敏感。化肥配施有机肥处理显著提高了旱作土壤全氮含量、易分解氮含量及其占全氮的比例,效果优于秸秆还田,更优于化肥处理。

关键词：易分解氮；耐分解氮；旱地；水田；长期施肥

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直播和育苗移栽是目前长江流域冬油菜并存的两种栽培方式,其技术发展和推广状况对中国油菜产业发展和油料供应安全具有重要意义。不同的历史阶段下,随栽培品种、种植目标、劳动力条件和生产力水平等因素的变化,中国冬油菜栽培方式也在不断的转变和发展。文章概述了新中国建立后冬油菜栽培方式的发展变化历程,从最初以直播种植为主,到20世纪60年代中期直播为主而育苗移栽开始起步,20世纪80年代育苗移栽方式实现全面推广并长期应用,再到当前直播和育苗移栽两种栽培方式并存。而养分管理措施也经历了从最初施用农家肥,到开始施用氮、磷化肥,到提倡氮、磷、钾、硼肥配合施用,再到当前形成的育苗移栽油菜高产高效养分管理技术。直播和育苗移栽油菜的栽培特点和生长过程存在着显著差异,文章主要从生育进程、种植密度、群体结构与个体形态等方面对两者进行了分析和比较。相比育苗移栽油菜,直播油菜的生育期一般相应缩短,个体生长状况较弱,单株产量偏低,但在较高的种植密度基础上可发挥群体优势,且根群结构也有助于增强养分和水分吸收能力,因此具有高产高效的潜力。目前,长江流域育苗移栽油菜的养分丰缺指标和推荐施肥体系已经建立,养分管理策略也较为完善,其要点为:根据土壤肥力状况和目标产量水平合理确定氮、磷、钾、硼肥用量,保证养分平衡供应,实行有机无机肥料配合施用,采取氮、钾肥分次施用(推荐基肥﹕越冬肥﹕薹肥=60%﹕20%﹕20%)以协调生长发育和养分吸收,强壮个体而实现高产。针对直播油菜发展迅速而在高产条件下养分管理研究相对滞后的现状,文章重点比较了其与育苗移栽油菜在养分响应、吸收分配和需求利用等方面的差异,发现直播油菜对养分缺乏较为敏感,养分不足导致个体生长低下和群体衰亡,后期物质和养分转运效率较低,而且对磷、钾养分的需求明显更高。基于已有研究结果总结出直播油菜的“前促后稳”养分管理策略,即在氮、磷、钾及微量元素养分合理平衡施用基础上,保证磷、钾供应,施用有机肥并进行秸秆还田,肥料运筹中重视氮肥对个体和群体发展的调控作用,减少基施而增加苗肥以促前期生长,中后期适时追肥以保证群体数量和产量形成,推荐基肥﹕苗肥﹕越冬肥﹕薹肥=40%﹕30%﹕15%﹕15%。此外,应配合其他栽培措施协同增效提质,选用适宜早熟和耐密的品种,采用机械化精量播种技术,施用长效专用复合肥或专用控释肥,配合密植以省肥补迟、增库促源,加强病虫草害防控技术。文章还对直播油菜养分管理研究中的问题和未来方向进行了探讨和展望,以期为进一步完善其栽培管理措施和科学施肥技术提供参考。

关键词：冬油菜；直播；育苗移栽；播种期；植株密度；养分管理

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【目的】了解猪流感病毒的分子流行病学,为动物流感的防控提供科学依据。【方法】将猪的鼻拭子接种鸡胚进行病毒分离,对血凝试验阳性的样品在SPF鸡胚上进一步纯化、增殖,采用RT-PCR对分离毒株的全基因组进行扩增,使用Applied Biosystems 3500x L Genetic Analyzer进行序列测定,利用DNASTAR软件对测序基因片段进行整个阅读框的核苷酸序列同源性比对分析,并用MEGA 6.0绘制遗传进化树及分析氨基酸位点。【结果】分离毒株A/swine/Zhejiang/245/2013(SW/ZJ/245/13)为H1N1亚型病毒,核苷酸的分析结果发现该分离毒株的8个基因片段均与中国近期分离的H1N1亚型流感病毒高度同源,属于类禽型猪H1N1的进化分支,没有出现不同基因型流感病毒片段之间的重组。分离株HA蛋白的裂解位点序列为IPSIQSR↓G,具有典型低致病力流感病毒的分子特征;HA蛋白5个抗原位点区域与其同源性最高毒株完全一致,表明抗原性未发生改变;HA蛋白受体结合位点中190 D以及225 E,表明SW/ZJ/245/13与SA-α-2,6-Gal受体有较强的结合能力,而SA-α-2,6-Gal受体普遍存在于哺乳动物宿主(猪和人)上呼吸道中;HA共有6个潜在糖基化位点,其中4个(N27、N40、N212和N291)位于HAl区,2个(N498和N557)位于HA2区;NA有7个潜在糖基化位点,其中4个(N50、N58、N63和N68)在链接区,其他3个(N88、N146和N235)在结构域;PB2蛋白具有271T、627E和701N的氨基酸组合;M2蛋白发生抗药位点S31N的突变。【结论】类禽型H1N1猪流感病毒的持续存在和不断变异,提示应加强猪流感的监测,为动物流感的防控提供重要的科学依据。

关键词：猪流感病毒；类禽型；H1N1；进化分析；分子特征

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 【目的】克隆大豆MYB转录因子基因,进行序列分析和表达模式分析,并对其功能进行鉴定。【方法】通过对盐胁迫相关的数字表达谱(DGEP)数据分析,获得一个MYB转录因子Gm MYB111;以盐胁迫处理的c DNA为模板,利用RT-PCR法分离克隆MYB基因c DNA编码序列;根据Gm MYB111蛋白序列进行同源性搜索,得到与Gm MYB111蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列;使用MEGA5.05对Gm MYB111蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建同源物种间系统进化树;利用实时荧光定量PCR方法检测目的基因在大豆中受非生物胁迫诱导表达情况及组织特异性表达情况;利用拟南芥原生质体转化体系分析Gm MYB111的亚细胞定位情况;通过酵母杂交系统检测其转录激活活性以及体外结合活性。【结果】根据前期江苏省农业科学院农业生物技术研究所盐土农业研究室盐胁迫相关的数字表达谱(DGEP)数据获得盐胁迫响应显著上调(27倍)的Gm MYB111,利用RT-PCR方法从栽培大豆根组织中克隆该基因片段,序列比对发现其与已公布的Williams82基因组数据库序列一致,生物信息学分析表明,其编码的氨基酸序列具有MYB类转录因子的共同特征,其N端具有R2、R3两个MYB结构域,同时其C-端还存在一个富含酸性氨基酸的转录激活区;系统进化树分析表明,该基因编码的蛋白与Gm MYB76、Gm MYB12a以及苜蓿Mt MYB61的亲缘关系最近;Gm MYB111在大豆中的表达受高盐、干旱、冷害和ABA诱导表达,实时荧光定量PCR检测结果显示,在高盐和冷害胁迫下,Gm MYB111呈上调表达,在干旱胁迫诱导后呈先上调后下调的表达模式,在ABA诱导下其表达量呈现波动式上调和下调表达;时空表达分析表明,Gm MYB111为组成型表达,在大豆幼苗期和成熟期的表达量相对较强,成熟期的表达量相对较低,从不同组织来看,Gm MYB111在茎、叶和花中表达量最高,在根中表达量相对较低,在豆荚中不表达;亚细胞定位结果显示Gm MYB111定位于细胞核中,为典型的转录因子;酵母杂交系统检测表明,Gm MYB111具有转录激活功能,并且能够与顺式作用元件TAACTG基序相结合。【结论】Gm MYB111为典型的R2R3-MYB转录因子基因,具有转录激活活性及DNA结合活性,在大豆中的表达可能与大豆的非生物胁迫和ABA信号转导途径有关,推测其可能通过调节下游基因的表达来调控大豆对非生物胁迫的应答。

关键词：大豆；GmMYB111；表达分析；结合基序；转录激活活性

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【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根据H7N9亚型禽流感病毒HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR检测方法。【方法】根据测序结果,用DNAStar生物软件进行同源性分析比较,选出H7和N9基因中高度保守且特异的核苷酸区域,用oligo6.0软件设计针对H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Access RT-PCR扩增反应液,建立了一步法检测H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR方法。以H7N9亚型流感病毒为阳性对照,其他亚型流感病毒以及新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊等其他禽病病原作为阴性对照,按所建立的反应体系和反应程序进行RT-PCR反应,验证所建立方法的特异性。对病毒含量为106.5 EID50·m L-1的H7N9亚型禽流感病毒尿囊液依次进行10倍倍比稀释,提取RNA用RT-PCR方法检测,评价其敏感性。另外,采取双盲试验用荧光定量RT-PCR对该方法进行了比对验证。【结果】用H7亚型特异性引物检测H1—H15亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原,除H7亚型流感病毒外,其他样品均为阴性;用N9亚型特异性引物检测N1—N9亚型禽流感病毒和其他禽病病原,仅当前流行的H7N9亚型AIV样品有特异性目的条带,与其他N1—N9亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原均无交叉反应。通过对H7N9亚型禽流感病毒尿囊液进行10倍倍比稀释检测,证实该方法最低检出量为1.4×102.5 EID50·m L-1,并可以从阳性棉拭子浸出液中扩增出目的基因片段。【结论】该RT-PCR方法具有特异性强和准确率高的特点,可以作为H7N9亚型AIV核酸检测的一种有效候选方法。

关键词：禽流感病毒；H7N9亚型；RT-PCR

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【目的】禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)根据其表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸(neuraminidase,NA)的不同,可分为16种HA和9种NA亚型。根据其致病力的差异可分为高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus,LPAIV)。虽然H4亚型禽流感病毒为低致病性AIV,感染家禽表现为无症状感染,但其对禽类甚至是哺乳动物是一个潜在的威胁,因此必须要加强对H4亚型禽流感病毒的调查监控。【方法】为了探讨H4亚型禽流感病毒的分子特征及遗传演化规律,对2010年在中国华东地区某活禽市场进行流行病学监测时分离到的一株H4N8亚型禽流感病毒A/duck/Nanjing/1102/2010(简称DK/NJ/1102)进行了全基因组序列测定及遗传进化分析。通过常规的血清学试验确定其HA亚型,提取病毒总RNA,并通过RT-PCR方法分别扩增出其各基因片段,连接p GEM-Teasy载体上后进行序列测定。利用Gen Bank中的BLAST工具进行核苷酸序列的同源性分析,并与Gene Bank中的H4亚型流感病毒及其它相关序列进行遗传进化分析。【结果】DK/NJ/1102的HA基因与Mongolia分离株A/duck/Mongolia/274/2007(H4N3)的核苷酸同源性最高,为98.9%。推导的氨基酸剪切位点序列为“P-E-K-A-S-R-G”,符合典型的低致病性禽流感病毒特征;NA基因与华东地区分离的鸭源毒株A/Duck/Eastern China/n91/2009(H3N8)核苷酸同源性最高,达99.4%;PB1、PA和NP基因均与H1亚型禽流感病毒亲缘关系最近;M基因与A/wild duck/Korea/CSM4-12/2009(H5N1)核苷酸同源性最高,高达99.9%;NS基因与韩国2009年分离的H7N7亚型流感病毒遗传距离最近。NS1蛋白的80-84处氨基酸没有发生氨基酸缺失。【结论】该H4N8亚型禽流感病毒基因组构成比较复杂,可能是一株多基因重组病毒。

关键词：禽流感病毒；H4N8亚型；遗传进化分析；重组

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