关键词：棉花；GbU6启动子；克隆；花粉；瞬时表达
摘 要：【目的】以棉花品种新海16基因组DNA为模板,克隆海岛棉(Gossypium barbadense L.)Gb U6启动子,筛选出能在棉花生殖细胞中(花粉)高效转录的Gb U6启动子,为利用基因组编辑技术进行棉花分子育种奠定重要基础。【方法】采用两轮PCR方法克隆完整的Gb U6启动子。根据网上公布的棉花基因组数据库序列,利用Primer5.0软件设计5对引物,进行第一轮能覆盖完整Gb U6启动子的PCR扩增,产物克隆测序正确后,再利用transfer PCR法将Gb U6启动子精确亚克隆到CRISPR/Cas9基因组编辑载体中;第二轮扩增产物测序正确后,运用DNAMAN软件对克隆成功的5个Gb U6启动子序列中具有转录功能的必要元件进行分析;然后以p BI101质粒DNA为模板,PCR扩增并克隆GUS报告基因,经酶切鉴定、测序正确后,用BbsⅠ酶切GUS,连入经同样酶切后的5个Gb U6启动子对应的CRISPR/Cas9基因组编辑载体中,转化、酶切鉴定,获得对应的5种Gb U6::GUS的表达载体。将含有Ca MV35S启动子驱动的GUS表达载体作为棉花花粉瞬时转化的阳性对照,以上述6种表达载体DNA为模板,采用高保真酶的PCR扩增法获得高浓度DNA片段,利用基因枪轰击法将5种Gb U6::GUS和阳性对照的DNA片段分别转化棉花花粉,并进行GUS染色,最后用体式显微镜观察染色情况。每个启动子的基因枪转化重复3次,最后根据染色深浅筛选出在棉花生殖细胞中高效转录的Gb U6启动子。【结果】经两轮PCR扩增后获得5种Gb U6启动子,启动子长度分别为1 166、1 119、1 134、1 214和1 176 bp,并构建获得了相应的5种CRISPR/Cas9基因组编辑载体;对拟南芥和克隆的5个Gb U6启动子序列进行序列比对,结果表明,Gb U6启动子区与拟南芥U6启动子一样,也含有比较保守的-60 bp位置的USE元件和-30 bp位置的TATA框,而且这两个元件之间的距离也非常固定;用Gb U6::GUS的DNA片段瞬时转化棉花花粉,发现基因枪瞬时转化的3次重复结果显示克隆得到的5个Gb U6启动子有4个能驱动GUS在棉花花粉中表达,棉花花粉被染成蓝色。其中Gb U6-5P::GUS的染色相对较深,接近于Ca MV35S启动子。【结论】成功克隆了棉花生殖细胞中高效转录的Gb U6启动子,为构建棉花CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统提供了有效的启动子。