关键词：超高效液相色谱;串联质谱;维生素D;25-羟基维生素D;衍生化反应;4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮
摘 要：动物源性食品是人体摄入维生素D和25-羟基维生素D的重要食物来源。目前我国相关标准限于维生素D的含量测定,使用非衍生化方法进行检测。本研究以4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮（PTAD）作为衍生试剂,通过Diels-Alder反应,在维生素D和25-羟基维生素D上引入易电离基团,提高离子化效率,建立了衍生化-超高效液相色谱-串联质谱联用法（UPLC-MS/MS）同时测定动物源性食品中维生素D和25-羟基维生素D的检测方法。本研究对衍生化条件、样品前处理条件、色谱分离条件和质谱检测条件进行了优化。结果表明,在乙腈溶剂中,目标化合物与衍生试剂PTAD质量比为1∶10 000的条件下,衍生反应充分;衍生反应1 h后达到稳定;相较于Silica和C₁₈固相萃取（SPE）柱,HLB SPE柱对目标化合物的回收率更高,同时可有效降低基质效应的影响;在水-甲醇流动相体系中添加5 mmol/L甲胺,可显著提升目标化合物的检测灵敏度。样品经过均质,加入同位素内标,碱液皂化,萃取浓缩,固相萃取柱净化和化学衍生,在Waters Acquity UPLC BEH C₁₈色谱柱（100 mm×2.1 mm, 1.7μm）上,以0.1%甲酸-5 mmol/L甲胺水溶液和0.1%甲酸-5 mmol/L甲胺甲醇溶液作为流动相梯度洗脱。分析物在电喷雾正离子模式（ESI⁺）下进行多反应检测（MRM）测定,内标法定量。结果表明,维生素D和25-羟基维生素D在0.20～50.0μg/L内线性良好,相关系数为0.999 5～0.999 9,方法检出限为0.018～0.066μg/kg,方法定量限为0.06～0.22μg/kg,在0.20、1.0、5.0μg/kg 3个加标水平下,加标回收率为92.6%～99.4%,相对标准偏差为3.6%～5.2%。该方法灵敏度高,重复性好,适用于动物源性食品中维生素D和25-羟基维生素D灵敏、准确的定量检测。
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