关键词：紫花苜蓿；Ms NAC2；基因克隆；功能分析
摘 要：【目的】NAC转录因子是植物特有的一类转录因子,N端含有一段高度保守、约150个氨基酸组成的NAC结构域,而C端为高度变异的转录调控区。NAC转录因子不仅参与植物生长发育的调控,而且在植物抗逆反应中具有重要的调控作用。作者从紫花苜蓿中克隆了一个NAC类转录因子基因Ms NAC2,期望通过分析其DNA和氨基酸序列特征,阐明其在紫花苜蓿中响应非生物胁迫的表达模式,通过在烟草中过量表达鉴定其生物学功能,为进一步了解Ms NAC2在紫花苜蓿中的耐逆调控机理提供试验基础,并为通过转基因技术改善紫花苜蓿抗逆力和提高其品质奠定研究基础。【方法】应用RT-PCR和RACE技术获得紫花苜蓿Ms NAC2全长序列,并进行生物信息学分析。应用real-time PCR技术分析该基因在非生物胁迫下的时空表达特征。构建Ms NAC2-GFP融合表达载体,进行基因表达的亚细胞定位分析。同时构建p BI121-Ms NAC2植物超表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草叶盘,比较逆境胁迫条件下野生型烟草和转基因株系的表型和生理指标,鉴定超表达Ms NAC2对烟草耐逆能力的调控效应。【结果】Ms NAC2全长1 358 bp,开放阅读框长度为1 023 bp,编码340个氨基酸,编码蛋白质分子量为39.4 k D,其N端含有典型的NAC保守结构域,C端高度变异。进化树聚类分析表明,该基因与脐橙Cs NAC亲缘关系较近,属于NAC蛋白的ATAF亚家族。洋葱亚细胞定位分析表明Ms NAC2定位于细胞核。转录水平表达分析表明Ms NAC2受250 mmol·L-1Na Cl、20%PEG6000、0.1 mmol·L-1 ABA和4℃胁迫诱导而显著升高,并且Ms NAC2在根中的表达量要明显高于在叶中的表达量。抗性试验结果显示,在Na Cl、PEG和4℃冷害胁迫下,转基因烟草苗高、根长、鲜重和干重等生长指标均高于野生型。生理指标检测结果表明,在250 mmol·L-1 Na Cl、20%PEG6000和4℃处理24 h后,转基因烟草叶片丙二醛含量明显低于野生型烟草,分别为野生型的82.6%、73.2%和77.8%。脯氨酸含量高于野生型烟草,分别达1.52倍、1.72倍和2.24倍,且SOD和POD的活性均高于野生型烟草,分别为野生型的1.101倍、1.105倍、1.33倍和1.12倍、1.08倍及1.19倍。【结论】从紫花苜蓿中克隆了一个新的NAC转录因子基因Ms NAC2,该基因能够对盐、冷害和干旱胁迫产生响应,与野生型烟草相比,过量表达Ms NAC2烟草具有较强的耐盐、抗旱和抵御寒冷的能力,说明该基因可能参与调控非生物逆境胁迫的生理响应。