关键词：中华鳖;;急性冷胁迫;;岩藻糖基转移酶2;;闭合蛋白;;细菌
摘 要：为了研究急性冷胁迫对中华鳖(Pelodiscus sinensis)肠道粘膜机械屏障的影响,本论文首先克隆了中华鳖fut2的cDNA全长,从基因结构、相似性、系统发育和蛋白结构等方面对其进行生物信息学分析;采用qPCR手段进行了组织表达模式分析。其次从二胺氧化酶酶活、肠道组织结构和蛋白表达水平等方面研究了急性冷胁迫后中华鳖肠道粘膜形态以及紧密连接关键因子Occludin蛋白的表达变化;随后研究了急性冷胁迫对中华鳖肠道粘液层和岩藻糖基化的影响;最后探究了急性冷胁迫对fut2和occludin的影响,我们采用两个温度(25°C,15°C)、两种细菌(革兰氏阴性与阳性菌)体内攻毒的方式在5个时间点(6、12、24、72 h和7 d)来检测fut2和occludin在肠道中的表达变化情况。实验结果如下:1.中华鳖fut2全长cDNA的克隆及组织表达模式分析中华鳖fut2的cDNA序列全长为1918 bp,其中5’非编码区5’-UTR(380 bp),3’非编码区(3’-UTR)518 bp,开放阅读框长度为1020 bp,编码339个氨基酸残基。Fut2蛋白是一个没有信号肽的脂溶性蛋白,包含一个Glyco_transf_11结构域;对其系统进化树分析显示,中华鳖fut2与西部锦龟和绿毛龟的亲缘关系相对较近,与人和小鼠等亲缘关系相对较远。组织表达模式分析结果显示,fut2在中华鳖10个组织中均有表达,其中在肌肉、心脏中表达量较高,在胃、肾脏和脑中表达量较低,在回肠、直肠、肺、脾脏和肝脏中呈现中等表达水平。2.急性冷胁迫对中华鳖肠道组织结构完整性的影响第一次急性冷胁迫实验中,中华鳖血清DAO活性随急性冷胁迫时间的增加而呈现降低趋势,并在冷胁迫到达48 h降到了最低水平;急性冷胁迫及复温实验中,中华鳖血清DAO的活性,在急性冷胁迫3 d后显著降低,但随着温度的恢复,DAO活性又恢复到正常水平。组织病理结果表明:急性冷胁迫对中华鳖肠道(回肠后段和大肠)粘膜上皮的形态没有明显影响;急性冷胁迫对回肠后段绒毛长度、绒毛长度和隐窝深度的比值没有显著影响,但会使回肠后段粘膜厚度显著降低,对大肠粘膜厚度没有显著影响。3.急性冷胁迫对中华鳖肠道粘液层的影响急性冷胁迫后,各组中华鳖回肠后段杯状细胞数与对照组相比没有显著变化,大肠急性冷胁迫3天组杯状细胞数目显著低于急性冷胁迫3天对照组杯状细胞数目。中华鳖回肠后段急性冷胁迫3天组的粘液厚度,显著高于急性冷胁迫3天对照组;大肠急性冷胁迫3天组粘液厚度显著低于急性冷胁迫3天对照组。中华鳖回肠后段急性冷胁迫前对照组的荧光强度显著低于其他各组,而急性冷胁迫3天组的荧光强度与冷胁迫3天对照组相比并无显著差异。4.细菌胁迫及急性低温胁迫对中华鳖肠道粘膜机械屏障关键因子fut2和occludin mRNA表达的影响中华鳖回肠后段和大肠fut2基因的表达在感染嗜水气单胞菌或金黄色葡萄球菌后基本呈现下降的趋势。回肠后段occludin基因的表达在感染嗜水气单胞菌或金黄色葡萄球菌后急性冷胁迫组表达量在感染前期(6和12 h)极显著高于常温对照组,在感染的中期和后期(24、72 h和7 d)极显著低于常温对照组。大肠occludin基因的表达在感染嗜水气单胞菌后急性冷胁迫组表达量在感染前期(6 h)极显著低于常温对照组;在感染金黄色葡萄球菌后急性冷胁迫组表达量在感染前期和中期(6、12和24 h)显著低于常温对照组,而在感染7 d时表达量显著高于常温对照组。同一温度下不同细菌处理的分析得出,细菌单独刺激不会对中华鳖肠道fut2的表达产生显著影响,而对occludin表达影响显著。结论:1.克隆得到了中华鳖的fut2的cDNA序列并对其进行了生物信息学分析,弥补了爬行动物fut2研究的空白。2.通过检测中华鳖肠道粘膜屏障的一系列相关指标,可以得到中华鳖肠道在相同的冷胁迫下,不同肠段对急性冷胁迫具有各自特殊的应对方式。3.急性冷胁迫会降低中华鳖大肠粘液厚度和杯状细胞数目,提示着中华鳖肠道粘膜受损。4.急性冷胁迫会破坏中华鳖肠道粘膜机械屏障的完整性,但不会对中华鳖肠道粘膜抵御细菌入侵的能力造成影响。
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