关键词：脊髓神经细胞;;机械损伤;;牛磺熊去氧胆酸;;自噬
摘 要：目的探讨TUDCA对用无菌刀片机械划伤法构建SD大鼠脊髓神经细胞机械损伤模型诱导自噬的影响。方法通过刘希伟和齐建国等人的体外培养脊髓神经细胞的方法,结合自己的实际情况和具体要求来体外培养SD大鼠脊髓神经细胞。用脊髓神经细胞的尼氏染色法,来鉴定所培养的SD大鼠原代脊髓神经细胞。参考阙海萍等人的方法,来制备SD大鼠脊髓神经细胞机械损伤模型,划伤间隔分别为1mm组,3mm组,5mm组;分别在给予无菌刀片机械损伤后的,6小时、12小时、24小时、48小时、72小时后,用倒置显微镜观察损伤的模型。损伤模型制备完成后用MTT法来观测细胞的抑制率,这样通过这两种方法综合测定制备的SD大鼠脊髓神经细胞机械损伤模型,以确定药物干预的时间及损伤程度。分别配制0.5mmol/L、1.0mmol/L、2.0mmol/L、4.0mmol/L、6.0mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L的牛磺熊去氧胆酸,用MTT法来测定最适的药物浓度。把培养的细胞接种在经严格灭菌处理的六孔板中,分为空白组(不作处理)、对照组(机械损伤)、实验组(机械损伤加TUDCA)分别用电子显微镜观察脊髓神经细胞中自噬现象的发生发展过程和脊髓神经细胞的生物学特征。把培养的细胞接种在经严格灭菌处理的六孔板中,分为空白组(不作处理)、对照组(机械损伤)、实验组(机械损伤加TUDCA),分别提取蛋白,应用免疫印迹试验的方法,将自噬相关因子Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ进行对比观测。把培养的细胞接种在经严格灭菌处理的六孔板中,分为空白组(不作处理)、对照组(机械损伤)、实验组(机械损伤加TUDCA),应用免疫组化的方法,检测自噬相关因子Beclin-1和LC3的表达情况。结果在体外培养的SD大鼠原代脊髓神经细胞鉴定结果:经过在倒置显微镜下察看的细胞形态和脊髓神经细胞的尼氏染色,证明了所培育的细胞为脊髓神经细胞而且其纯度在90%之上。机械损伤模型MTT法鉴定结果:经MTT法检测细胞的抑制率,在划伤间隔为3mm损伤时间为24h时细胞的抑制率最接近50%,与各组比较均有统计学差异(P
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