关键词：海栖热袍菌;嗜热酶;磷酸戊糖变位酶;基因克隆;响应面;优化
摘 要：二十一世纪,开发和利用海洋生物资源已成为全球关注点之一,对极端海洋环境微生物的研究也上了一个新层次。因此对极端酶的研究也广泛引起了海内外专家的兴趣,尤其嗜热酶已经在许多领域有了较好的应用。海栖热袍菌(Thermotoga maritime)是一种来源于深海火山的极端嗜热菌,生长环境特殊难以大规模的发酵培养,其酶资源用于工业化生产十分困难。使用基因工程手段对极端环境微生物的酶基因加以克隆并进行高效表达,是目前利用极端环境微生物酶资源的主要方法。本课题主要研究了海栖热袍菌表达的内切-1,4-β-葡聚糖酶(TM1525)、阿拉伯内切-1,4-β-半乳聚糖酶(TM1201)、磷酸戊糖变位酶(TM1067)三种嗜热酶。采用基因克隆技术构建表达嗜热酶的基因工程菌,通过层析柱处理加以纯化成功表达的外源蛋白酶,已有文献报道嗜热磷酸戊糖变位酶(PPM)的主要酶活性质,因此本文应用响应面法对工程菌发酵产PPM的条件进行优化。本文的主要研究内容及结果如下:1.以海栖热袍菌(Thermotoga maritima)基因组为模板,根据内切-1,4-β-葡聚糖酶、阿拉伯内切-1,4-β-半乳聚糖酶、磷酸戊糖变位酶三种嗜热酶基因序列设计引物,质粒p ET-32a(+)为表达载体,E.coli BL21(DE3)为表达菌株,成功构建表达海栖热袍菌嗜热酶的三种工程菌。2.研究三种工程菌的生长曲线,以IPTG为诱导剂进行诱导表达,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白免疫印迹等方法进行检测,结果显示内切-1,4-β-葡聚糖酶、阿拉伯内切-1,4-β-半乳聚糖酶未在工程菌中成功表达,磷酸戊糖变位酶成功表达。3.运用生物信息学软件,对成功表达的目的蛋白酶理化性质进行分析;采用Ni-NTA树脂层析柱对目的蛋白进行纯化,结果显示可以得到电泳纯的磷酸戊糖变位酶。4.通过Plackett-Burman设计、最陡爬坡试验和Box-Behnken试验设计构建回归方程对磷酸戊糖变位酶发酵条件进行优化。结果显示,最佳发酵条件为诱导种龄OD600 0.6,诱导温度22.5℃,诱导时间13h,IPTG浓度0.45m M,培养基p H7.6,接种量2.25%。在此条件下磷酸戊糖变位酶表达量较初始发酵条件提高了约1.53倍。
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