关键词：铅暴露;神经元发育;经典Wnt信号通路;MLL1;LncRNA
摘 要：食品安全与人类健康息息相关,而随着环境问题的突出,食品源性铅暴露屡见不鲜。铅是一种传统的重金属污染物,对神经系统尤其是中枢神经系统具有毒性效应。本研究组的前期工作结果表明,发育期铅暴露会对大鼠大脑认知功能造成一定的损伤,但是其内在具体机制尚未完全明确。近来,有研究表明铅暴露对神经元发育过程有抑制作用,但对其内在调节机制研究甚少。目的:研究铅暴露对Sprague-Dawley(SD)大鼠海马区神经元增殖、分化的影响及相关信号通路;研究铅暴露调节神经元成熟的详细生物分子机制进而推测其致神经退行性疾病的潜在机制。方法:1.SD大鼠按照雌雄1:3配对后随机分为正常对照组和铅暴露组。正常对照组饮用蒸馏水,铅暴露组饮用铅水(250ppm醋酸铅溶于蒸馏水,30mL/d)。实验鼠自胚胎期开始接受铅暴露,出生后至断奶前(出生后21天)通过母乳间接接受铅暴露,断奶后通过饮用铅水直接接受铅暴露。对照组和铅暴露组幼鼠均于出生后第19天至21天通过腹腔注射给予5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU),40mg/kg,每天一次,于第22天断头取材。免疫组织化学观察海马区新生神经元数量,Western blot检测经典Wnt通路相关蛋白表达量,Real-time Quantitative PCR(q-PCR)检测经典Wnt通路中mRNA的表达。2.以离体培养的海马神经元为实验材料,从RNA调控水平深入探究铅暴露抑制神经元发育的分子机制。取新生大鼠(出生后24小时内,P0)原代海马神经元进行细胞培养,体外培养第3天开始进行醋酸铅(5μM)处理,连续暴露11天,于第14天收样。Western blot实验和q-PCR实验分别从蛋白水平和mRNA层面检测Kmt2a(MLL1)的表达,同时q-PCR实验检测具有招募功能的长链非编码RNA(LncRNA)的表达。结果:1.铅暴露显著降低SD大鼠海马区新生神经元数目(BrdU标记)。2.铅暴露显著升高磷酸化β-catenin蛋白水平,降低磷酸化GSK-3β蛋白水平,而对GSK-3β和β-catenin总体蛋白水平没有产生显著影响。此外GSK-3β在mRNA水平上显著上升。3.铅暴露显著抑制MLL1蛋白水平和mRNA水平的表达。4.铅暴露可影响H3K4me3在染色质中分布,并且这种改变可能是通过影响具有招募功能的LncRNA表达实现的。结论:本研究从经典Wnt信号通路和靶分子H3K4me3两个分子机制作为切入点共同探究发育期铅暴露对大脑新生神经元的增殖、分化以及成熟两个方面过程的影响。1.发育期铅暴露可能通过抑制经典Wnt通路来影响发育期大鼠海马区新生神经元增殖、分化。2.对神经元发育成熟过程有重要调节作用的MLL1分子的表达受铅暴露影响,同时改变了H3K4me3在染色质上的分布,并且这一过程可能是通过调控具有招募功能的LncRNA实现的。该研究成果从神经元发育的角度为今后关于发育期铅暴露的神经毒性的研究提供了新的视野。
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