关键词：赭曲霉毒素;单克隆抗;酶联免疫吸附法;免疫层析;快速检测
摘 要：随着科技的发展,人们的生活水平的提高,食品卫生与安全已经成为人们普遍关注的话题。但是近年来,由各种食品安全因子导致的食品安全事件层出不穷,给民众带来了恐慌,因此,为维护食品安全及民众健康,建立食品安全因子的快速、高效检测技术意义重大。赭曲霉毒素是一种有毒真菌代谢产物,对动物和人类具有肾脏毒、肝毒、致畸、致癌、致突变和免疫抑制作用。本研究以污染农产品的赭曲霉毒素为检测对象,分别构建了酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒、纳米金免疫层析试纸条产品,实现了农产品中赭曲霉毒素的快速检测。本论文研究成果如下:1、抗赭曲霉毒素单克隆抗体的制备、纯化及免疫学鉴定:以OTA-BSA为免疫原免疫6周龄的Balb/c健康雌性小鼠,第四次免疫完成后尾部取血,测定血清的效价以及亲和力,选择具有较高亲和力血清的小鼠进行细胞融合。本实验以液体培养基法进行杂交瘤细胞的培养,有限稀释法对杂交瘤细胞进行单克隆化,经ELISA方法,最终筛选出8株分泌抗赭曲霉毒素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株:11B9、11D2、11G6、11C5、1E2、11F5、11A9、11E10,这8株细胞所诱导产生的腹水灵敏度(以IC50表示)分别为0.52ng/mL、0.68 ng/mL、1.30 ng/mL、1.08 ng/mL、45.79 ng/mL、1.25 ng/mL、1.50 ng/mL、1.27 ng/mL,所筛选出的杂交瘤细胞株所分泌的抗体对其他真菌毒素没有抑制作用,具有较强的特异性。2、赭曲霉毒素A检测ELISA试剂盒的研制及其特性鉴定:以抗赭曲霉毒素A的单克隆抗体为基础,建立了简单、灵敏、高效的赭曲霉毒素A检测ELISA方法,通过棋盘滴定法确定抗原OTA-BSA最佳包被浓度为2μg/mL,抗体稀释8000倍,酶标二抗稀释5000倍,在此条件下对ELISA的各个步骤进行优化。在最佳条件下进行实验,绘制标准曲线,得到线性方程:y=-0.3613x+0.3411;R2=0.9576,通过竞争抑制曲线确定IC50为0.22 ng/mL。试剂盒检测批内变异系数(CV)平均值为3.62%,批间CV平均值为3.74%,具有较高的精确度。使用该检测方法分别对黄豆、花生、玉米样品进行检测,添加回收实验测得的样品回收率均在90%以上,表明该试剂盒可用于农产品中赭曲霉毒素的检测。3、主要赭曲霉毒素快速检测免疫层析试纸条的构建及特性鉴定:本实验构建了食品中三种主要赭曲霉毒素的快速检测免疫层析方法,并研制了相应的试纸条产品。以柠檬酸还原氯金酸,制备了颗粒大小为15 nm的纳米金颗粒,作为信号标记材料。对实验条件进行优化,最终该免疫层析试纸条对OTA、OTB、OTC的检测限分别为0.05 ng/mL、0.025 ng/mL、0.1 ng/mL,消线浓度为0.5 ng/mL、0.25 ng/mL、0.5 ng/mL。该试纸条对其他结构类似真菌毒素没有抑制作用,特异性强,重复性好,在干燥条件下4℃可保存六个月。在玉米、花生、燕麦样品中对OTA、OTB、OTC的检出限分别为0.2μg/kg、0.1μg/kg、0.4μg/kg,该灵敏度远低于欧盟对未加工谷物中赭曲霉毒素所规定的最大残留限量5.0μg/kg,表明该试纸条可用于农产品中赭曲霉毒素的现场检测。
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