关键词：克林霉素;;林可霉素;;黄曲霉素B_1;;残留检测;;ELISA
摘 要：克林霉素(Clindamycin,CLIN)和林可霉素(Lincomycin,LIN)经常作为兽药而残留在动物源性食品中,黄曲霉素在绝大多数坚果类、粮油类里都有检出。CLIN和LIN的残留不仅可能导致恶心、注射部位疼痛等,也可能升高患伪膜性肠癌的风险。黄曲霉素B_1(Aflatoxins B_1,AFB_1)是黄曲霉素中毒性最强也是经常被检出的代表之一,具有强烈的致癌作用。本研究主要内容如下:1、CLIN单克隆抗体的制备:以琥珀酸酐法、活化酯法和高碘酸钠还原法制备CLIN和LIN免疫原和包被原,经质谱检测计算偶联比率为3.9至6.7。使用免疫原CLIN-BSA免疫小鼠后,检测小鼠均产生了特异性抗体。选取抗血清灵敏度和效价最高的鼠,成功制备了能稳定分泌单克隆抗体的细胞株3B9。基于3B9制备的单克隆抗体,建立间接竞争ELISA方法。该方法的抗体亚型为IgG1,轻链亚型为λ型,工作浓度为0.096μg/mL,包被抗原工作浓度为0.12μg/m L,此时测得的OD_(max)为1.795,CLIN的IC_(50)为1.2 ng/m L。该抗体对LIN有较明显的交叉反应,交叉反应率为25%,IC_(50)为5.8 ng/mL。2、建立了检测牛肉、鸡肉、猪肉、鱼肉中CLIN和LIN残留的间接竞争ELISA方法:以上述单克隆抗体为基础,用LIN-OVA作为包被原包被酶标板,建立异源性间接竞争ELISA方法,并对影响ELISA方法工作性能的因素进行优化。在最适宜条件下,检测CLIN和LIN的ELISA方法的标准曲线的IC_(50)值分别为0.3ng/mL(CLIN)和1.2 ng/mL(LIN)。优化建立了一个简单的样品前处理方法,10分钟内基质效应基本消除,可检测牛肉、鸡肉、猪肉、鱼肉中CLIN和LIN残留。该ELISA方法检测上述食品基质的检测限分别为1.8μg/kg(CLIN)和6.8μg/kg(LIN)。在添加回收试验中,在不同的添加水平范围内,平均回收率从76%到112%不等,批内/批间变异系数在7.1%到13.2%之间,均不超过15%。该ELISA方法经国家标准LC-MS/MS方法验证,相关系数R~2为0.9653,符合中国、欧盟和美国关于食品基质中CLIN和LIN残留检测的要求。3、建立了大米和米粉中AFB_1残留的间接竞争ELISA方法针对南方地区广泛食用的大米、米粉等食品基质,优化建立了间接竞争ELISA方法。新建立的方法的特异性好,对AFB_1有很好的识别水平,其IC_(50)值为0.4 ng/mL,对其他种类真菌毒素的识别能力较弱,交叉反应率在1%以下。本研究优化建立了一种快速检测大米、米粉中AFB_1残留的样品前处理法。该ELISA方法检测大米和米粉中AFB_1残留的检测限为0.89μg/kg。在添加回收实验中,平均回收率范围为73.9%?102.7%,批内和批间的CV范围为5.16%?11.36%,均在可接受范围内。该方法经国家标准LC-MS/MS方法对比验证,相关系数R~2为0.9943,证明该方法准确性满足中国、欧盟、美国对于食品基质中AFB_1残留检测的要求。
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