关键词：胸主动脉瘤/夹层;机械牵张力;平滑肌细胞;衰老;ADP;P2ry12
摘 要：背景胸主动脉瘤/夹层(Thoracic aortic aneurysm/dissection,TAAD)是凶险的心血管疾病之一,主要表现为血管进行性的扩张、破裂。组织病理学特点是血管中层降解,包括平滑肌细胞缺失和细胞外基质降解,伴有大量炎症反应,但具体分子机制尚未给予阐述。转录组测序技术(RNA Sequencing,RNA-seq)能够从整体水平研究基因功能以及基因之间的相互作用,揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机制,但是目前RNA-Seq技术尚未运用于TAAD发病分子机制研究中。平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)作为血管壁重要的组成成分,除了调控血管壁收缩,还分泌细胞外基质维持血管壁的稳定结构。近年研究,SMC衰老调控炎症反应,参与多种血管疾病发生,但是SMC衰老是否参与TAAD形成以及在此过程中的作用及作用机制仍不清楚。因此本研究使用RNA-Seq技术在整体转录组水平研究了TAAD形成的分子机制,以及在该过程中SMC衰老的作用及作用机制。目的利用β-氨基丙腈富马酸(β-aminopropionitrile monofumarate,BAPN)构建小鼠TAAD模型,于第0天、7天、14天和28天收取主动脉组织提取RNA,运用RNA-seq技术进行动态筛选,采用生物学信息分析软件进行分析,寻找在TAAD发生过程中不同时间点差异基因及信号通路,明确TAAD发生的分子机制。进一步分析细胞衰老相关信号通路,明确衰老在TAAD发生中的作用,阐明衰老参与TAAD形成的分子机制。方法1.小鼠TAAD模型制备:3周龄C57BL/6背景雄性小鼠,体重约9-10g,正常饮食,BAPN(1.0g/kg/day)溶于饮用水中,连续饮用28天,并于28天采用小鼠超声检测TAAD是否形成。2.HE染色:以观察TAAD病变组织的病理学结构特点。3.弹力纤维染色:以区分小鼠主动脉的内膜层,中膜层和外膜层,进而评价弹力纤维的完整性及断裂程度。4.基因组变化的检测:运用RNA-Seq技术(Illumina Hi Seq TM 2000)对BAPN诱导0、7、14、28天小鼠主动脉RNA样品进行测序,并对差异表达基因进行表达模式聚类分析、GO功能显著性富集分析和KEGG信号通路显著性富集分析。5.衰老及衰老细胞类型染色:BAPN诱导小鼠主动脉组织及机械牵张拉伸后SMC进行SA-β-gal染色,明确TAAD形成过程中及体外拉伸后细胞衰老情况。6.衰老相关分子表达水平检测:采用real-time PCR和western blot分别从RNA和蛋白水平检测衰老相关分子p21、p19及p53表达水平。7.小鼠主动脉平滑肌细胞分离:采用酶消化法分离小鼠主动脉平滑肌胞。8.ADP检测:血管组织中ADP采用高效液相色谱检测,细胞培养液中采用ADP检测试剂盒检测。9.炎症因子分泌检测:血管组织及细胞中采用real-time PCR检测(IL-6、IL-1β、MCP-1、TNF-α、IL-8、CXCL1),细胞培养液中采用Cytometric Bead Array(CBA)检测。10.炎症细胞浸润检测:免疫组化和免疫荧光染色明确血管组织中炎症细胞浸润水平。11.基质金属蛋白酶检测:采用real-time PCR和western blot分别从RNA和蛋白水平检测基质金属蛋白酶2、9(MMP2、MMP9)表达水平检测。12.统计学分析:所有数据都以平均值±标准差表示。符合正态分布的计量资料,两组间比较采用成组t检验,不符合正态分布的计量资料采用秩和检验。p
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