关键词：草鱼呼肠孤病毒;草鱼出血病;三重 PCR;基因型;流行病学调查;快速诊断;grass carp reovirus;grass carp hemorrhage disease;multiplex PCR;genotype;epidemiological survey;rapid diagnosis
摘 要：针对草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)各类型毒株的保守区域分别设计3对引物,优化反应条件和体系,建立了草鱼呼肠孤病毒三重 RT-PCR 检测方法,通过 PCR 扩增分别获得大小约为530 bp、297 bp 和196 bp的 DNA 片段.进一步分析表明,该检测方法具有良好的敏感性、特异性和稳定性,可以检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型核酸最低量分别约为260、190与230拷贝的病毒量,且某一类型的引物只能检测到同一类型的 GCRV.用建立的多重RT-PCR 方法对2008—2011年采集自江西、广东、湖北、浙江、重庆、四川、福建等地的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)主养区的86份草鱼出血病样品进行检测和初步流行病学分析.结果表明,Ⅰ型阳性率为9.3%,Ⅱ型阳性率为45.3%,Ⅲ型阳性率为2.3%,Ⅰ型和Ⅱ型混合感染阳性率为5.8%,Ⅱ和Ⅲ型混合感染阳性率为2.3%,其他类型的混合感染未检测到.表明目前主要流行的草鱼呼肠孤病毒为Ⅱ型.本研究建立的 GCRV 三重 PCR 检测方法可以特异性的检测各种类型的草鱼呼肠孤病毒,且具有较高的敏感性;利用该方法进行草鱼出血病初步的流行病学分析表明,目前主要流行的草鱼呼肠孤病毒为Ⅱ型,不同毒株类型混合感染的现象也普遍存在.本方法的建立旨在对草鱼出血病的快速诊断和分子流行病学调查提供实用的可操作手段.