关键词：离子液体;分散液液微萃取;赭曲霉毒素A;黄曲霉毒素B1;高效液相色谱
摘 要：真菌毒素污染是我国粮食数量和质量损失的原因之一,其污染途径较广,在农作物收割、不良干燥、包装、贮存以及运输过程中都有可能受真菌毒素的污染。常见的真菌毒素如粮食中的黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏玛菌素,水果中的展青霉素、链格孢霉毒素等大部分真菌毒素具有“致癌、致畸、致突变”作用,对人或动物有严重的危害。必须对重点真菌毒素进行检测和严密的监控。通常采用联合免疫技术与高效液相色谱等仪器方法进行真菌毒素的精准测定,这类方法检测真菌毒素灵敏度较高,重复性好,准确度高,单个样品分析时间在1h之内。该类方法成本较高且抗体不易保存。目前前处理技术正朝着微型化、经济环保的方向发展。离子液体-分散液液微萃取(Ionic liquid dispersive liquid-liquid microextraction,IL-DLLME)具有操作简单、检测速度快、成本低、富集效果好等优点,同时因离子液体替代了传统的高毒性氯化物使得IL-DLLME对环境以及人体的伤害更小,尤其是在灵敏度以及环境友好方面具有突出优势。近几年关于IL-DLLME在农产品和食品真菌毒素的检测报导较少,因此研究IL-DLLME在食品中真菌毒素的检测具有重要的现实意义。本研究主要针对农产品和食品中重点真菌毒素黄曲霉毒素和赭曲霉毒素,进行了高灵敏、精准检测的研究。实验主要研究了超声波、涡旋辅助萃取方式,将低毒环境友好的离子液体作为DLLME的萃取剂,结合高效液相色谱检测液态食品如食用油、果汁中的重点真菌毒素黄曲霉毒素B1以及赭曲霉毒素A。选择质地偏硬、均匀的固体颗粒为实验样品,利用温控辅助IL-DLLME对粮食中的黄曲霉毒素B1与赭曲霉毒素A进行同时检测。以含一定水分,质地较软,大小形态不均匀的固体食品为样品,进一步将QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged and safe)与IL-DLLME联合,检测葡萄干中的赭曲霉毒素A,并进行了方法学验证。具体结果如下:1、将IL-DLLME与高效液相色谱法结合,建立实验室快速检测液态食品中真菌毒素的方法。以非极性液态食品(食用油)中的黄曲霉毒素B1、极性液态食品(葡萄汁)中的赭曲霉毒素A为目标物,分别对萃取剂及萃取剂体积、分散剂及分散体积、水相pH值、离子强度、辅助方式、萃取时间等影响萃取效果的因素进行了研究。该方法检测食用油中的AFB1平均回收率为86.54%~103.92%,相对标准偏差2.86%~5.13%,最低检出限为0.03μg/kg,最低定量限为0.13μg/kg,富集倍数为9.90~10.57。该方法检测加标回收率以及实际样品测定结果与SN/T3868-2014检测结果无显著性差异,葡萄汁中的OTA平均回收率为83.88%~105.32%,相对标准偏差5.64%~7.83%,最低检出限为0.05μg/kg,最低定量限为0.17μg/kg,富集倍数为8.92~9.95,实际样品检测OTA含量未超过欧盟限量标准。本方法、操作简单、成本低、有机试剂用量小,适用于实验室快速检测液态食品中真菌毒素。2、建立了温控辅助萃取IL-DLLME高效液相色谱法同时快速检测粮食中的黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的新方法。采用单因素实验对萃取剂类型及体积、水相pH、溶解温度、冰浴时间等影响萃取效果的因素进行了研究。该方法检测粮食中的AFB1平均回收率为84.94%~94.98%,最低检出限为0.03μg/kg,最低定量限为0.11μg/kg,富集倍数为4.47~5.64,相对标准偏差低于7.53%;OTA平均回收率为92.65%~111.49%,最低检出限为0.08μg/kg,最低定量限为0.15μg/kg,富集倍数为5.01~5.64,相对标准偏差低于6.38%。实际样品检测中AFB1含量与OTA含量均低于国标限量标准,与国标中免疫亲和柱层析净化高效液相色谱检测结果无显著性差异。且本方法操作简单、成本低、有机试剂用量小。3、建立了QuEChERs结合IL-DLLME高效液相色谱法快速检测葡萄干中OTA的新方法。采用单因素实验对净化剂类型及其用量、提取剂pH、离子液体类型及用量、离子强度、萃取时间等影响萃取效果的因素进行了研究。该方法检测葡萄干中的赭曲霉毒素A在0.02~20μg/kg范围内有良好的线性关系(R=0.9998),最低检出限为0.02μg/kg,最低定量限为0.08μg/kg。加标回收率为86.29%~94.52%,富集倍数为7.83~9.90,相对标准偏差低于5%。实际样品检测OTA含量与欧盟标准免疫亲和柱层析净化高效液相色谱检测结果无显著性差异。且本方法操作简单、成本低、有机试剂用量小。
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