关键词：细胞末期促进复合物;少突胶质前体细胞;机械拉伸;细胞增殖;脊髓损伤
摘 要：研究背景:随着现代交通和建筑工业的快速发展,脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的发病率逐年增加,并成为青年人致残的主要原因之一。目前脊髓损伤与修复的机制还不清楚,临床上诊疗效果不能满足需求。少突胶质细胞是中枢神经系统内唯一形成髓鞘的细胞,其与神经元一样对损伤刺激非常敏感。近年来研究认为,脊髓损伤后少突胶质细胞凋亡导致幸存轴突脱髓鞘,是影响神经元轴突再生、修复的病理生理基础。因此,研究如何有效抑制凋亡以及促进损伤后少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)增殖活化是减轻脊髓损伤的一个重要环节。研究显示,细胞周期末期促进复合物(anaphase promoting complex,APC)及其调节亚基Cdh1在中枢神经系统生长、发育及损伤修复中具有重要的作用。最近的研究已证实Cdh1参与缺血性脑损伤后神经元凋亡和星形胶质细胞反应性增殖的病理生理过程,但APC-Cdh1在脊髓损伤后少突胶质前体细胞增殖活化中的作用,尚不清楚。本研究拟培养大鼠原代OPCs并建立体外细胞机械拉伸损伤模型,探究机械损伤后OPCs增殖活化是否与APC-Cdh1活性有关。其次,利用腺病毒介导的RNA干扰技术,探讨下调Cdh1对损伤后OPCs增殖活性的影响。最后,通过对干预前后Cdh1下游底物Id2和skp2的研究,探索Cdh1调控机械损伤后OPCs增殖活化的可能机制。本实验从细胞周期调控的角度出发,旨在研究APC-Cdh1在机械损伤后脊髓少突胶质前体细胞增殖活化中的作用及机制,从而为选择APC-Cdh1作为脊髓保护新靶点提供实验依据。第一部分大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞体外机械拉伸损伤模型的建立与评价目的:利用FX-4000T?柔性基底加载系统建立体外大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞机械拉伸损伤模型。方法:取新生48h内SD乳鼠脊髓,在原代混合胶质细胞培养的基础上利用改良的振摇法获得纯化的少突胶质前体细胞,并采用其特异性标志物A2B5进行免疫荧光细胞鉴定。利用FX-4000T?柔性基底加载系统建立少突胶质前体细胞机械拉伸损伤模型,将纯化培养3d的少突胶质前体细胞随机分为A组(对照组)、B组(拉伸幅度5%)、C组(拉伸幅度10%)、D组(拉伸幅度15%),拉伸2h后于倒置显微镜下观察各组细胞形态;MTT法检测细胞存活率;双染流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果:体外成功培育少突胶质前体细胞且A2B5阳性细胞约占90%。B组拉伸幅度对细胞形态及存活没有明显影响,基本不构成损伤。C组和D组细胞存活率较A组显著降低(P<0.05),凋亡率也明显升高(P
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