关键词：hTER;体外转录;RNA的纯化;SHAPE化学法
摘 要：端粒酶是一类独特的核糖核蛋白复合物,主要负责维护染色体末端端粒的完整性,以防止不完全DNA复制所造成的基因信息缺失,同时保护染色体的降解和重组。1985年,著名美国科学家、诺贝尔生理医学奖获得者Elizabeth H.Blackburn和Carol W.Greider首次在四膜虫(Tetrahymena)体内发现和鉴定出端粒酶。研究发现,端粒酶在大部分癌症中扮演上调因子的角色,同时其结构域的突变与多种早衰疾病相关,因此,在过去的二十年里,端粒酶成为了生物医学研究领域的焦点,尤其是人端粒酶。人端粒酶主要由一个逆转录酶(hTERT)和一个提供逆转录模板的RNA(hTER)以及一系列辅助蛋白组成。其中,人端粒酶RNA(hTER)的突变所导致的人端粒酶缺陷与几种人类遗传疾病相关,如先天性角化不良、再生障碍性贫血、脊髓发育不良和先天性肺纤维化等,因此,作为人端粒酶全酶的重要组成部分,对hTER的分子生物学和结构生物学研究可为相关疾病的治疗和药物的研发奠定基础。然而,在研究hTER结构这方面,目前不管是二级结构还是通过结晶实验获得三维结构,都因其较为复杂的结构特征而无法完成全长的三维结构解析,仅停留在部分区域的二级结构和三维结构的研究。人端粒酶RNA(hTER)是一条含有451个核苷酸的转录本,本文采用体外转录法获得hTER,并以SHAPE化学法(Selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension),即通过nmia(n-methylisatoic anhydride)或1m7(1-methyl-7-nitroisatoic anhydride)等小分子修饰hter后,经过逆转录获取对应的cdna片段,以此来分析rna序列的单核苷酸自由度和动态结构特性,为体外获悉hter全长的二级结构提供了实验依据。shape化学法是基于核糖2’-oh位置的亲核性,因此比起受碱基对和其他作用力束缚的核苷酸,不受约束的核苷酸能形成更多可以提高2’-oh亲核力的构象,从而与具有羟基选择性的亲电体,如nmia和1m7形成稳定的2’羟基加合物。在逆转录过程中,逆转录反应易在加合物处停止,从而生成不同长度的cdna,通过检测不同长度cdna的荧光值,可找到对应核苷酸的位置和自由度大小,从而判断该核苷酸在整个rna结构中的结构特征。本课题获得了以下成果:1)设计hter-shape基因和其对应的引物,并优化了pcr(polymerasechainreaction)反应体系,得到了高浓度、高纯度的dna作为体外转录的基因模板;2)通过体外转录获得了hter转录本,并对rna进行纯化,得到了满足shape实验要求的hter全长;3)摸索单引物一步法延伸完成较长rna(大于300nt)的逆转录反应条件,相比运用多个引物,提高了结果的一致性和准确度,其中对于hter(451nt),当选用1μm/lhter初始浓度和49℃延伸温度时,逆转录反应效果最佳,为其他类似高gc含量、序列较长的rna提供了实验基础;4)探索得到1μm/lhter经3.9mm/lnmia或5mm/l1m7修饰效果较好;5)采用shapefinder软件处理分析实验数据,结合已经报道的结果,预测当无hTERT蛋白时,hTER的模板区域一部分掩埋在三维结构中,该区域核苷酸自由度较低,一部分暴露在外,该区域核苷酸自由度相对较高;CR4/CR5结构域中P6.1具有相对较高的自由度,可能是hTERT蛋白结合的关键区域。同时,ScaRNA结构域中的Box H、CAB Box环状区、P8a与P8b之间的环状区以及3’末端区域,均可能为蛋白结合位点。以上成果证明了hTER SHAPE实验的可行性和有效性,通过对hTER全长单核苷酸自由度的分析所得到的结构推测,可作为研究人端粒酶RNA三维结构的依据。
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