关键词：机械通气肺损伤;;机械牵张;;E-cadherin,p120-catenin;;IL-6;;TNF-α;;IL-10;;机械通气肺损伤;;机械牵张;;NF-κB信号通路;;凋亡;;机械通气肺损伤;;机械牵张;;c-Src激酶;;磷酸化
摘 要：背景机械通气是通过呼吸机、麻醉机等呼吸辅助设备,控制或改变患者的自主呼吸运动,使患者气道保持通畅、维持患者的氧合正常、使患者不出现缺氧和二氧化碳蓄积的现象,最终使患者呼吸功能得以改善。随着社会经济的发展和人口老龄化的加重,各种原因所导致的呼吸衰竭的患者增多,因此,需要行呼吸机进行治疗的患者越来越多。机械通气是治疗呼吸功能衰竭的主要手段,但是,如果临床上机械通气策略应用不合理,会加重患者病情,出现肺组织损伤,即机械通气相关肺损伤。机械通气相关肺损伤(Ventilation induced-lung injury,VILI)是指在临床应用呼吸机或者麻醉机对患者进行机械通气时,由于呼吸机或麻醉机参数调节和肺部原发病交叉导致全身过度炎症反应,导致患者出现急性肺损伤(Acute lung injury,ALI),严重情况下可出现急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS),严重的氧供不足可导致患者心、脑等重要脏器损伤,即多器官功能障碍综合征(Mutiple organs disorder syndrome,MODS)。机械力牵张可导致肺泡细胞膜的完整性的破坏,影响细胞膜的通透性,引起肺泡水肿,进而引起肺损伤,同时机械力牵张可产生全身性炎症反应的失衡抗炎炎因子和促炎因子平衡被破坏,造成急性肺损伤。VILI的发生对于患者的康复造成严重的影响,同时患者的住院时间明显延长,治疗费用明显升高,给患者和社会带来负担。但是,目前对VILI的发生机制仍未完全研究清楚。研究VILI的机制主要集中于机械通气所造成的生物伤,主要包括炎症反应的失衡和通透屏障功能的降低。因此,本研究主要针对炎症反应和通透屏障功能这两方面对VILI发生机制和治疗手段进行研究,为VILI的治疗提供新的方法,具有重要的社会价值和科研价值。E钙黏素(E-cadherin)是上皮细胞内重要的粘附连接蛋白,在维持细胞的极性和完整性等方面起重要作用。p120连环蛋白(p120-catenin)是连环蛋白的一种,属于糖蛋白家族成员,是调节细胞内信号转导和细胞粘附连接的重要蛋白。E-cadherin通过其胞外结构域与其他蛋白组合构成粘附连接,E-cadherin介导的细胞间相互作用的破坏会增加屏障的通透性,提示E-cadherin在维持屏障功能中起关键作用。E-cadherin与α、β、γ和p120-catenin等连环蛋白形成复合体。在炎症反应过程中,连环蛋白是细胞信号传导的靶点,因此在调节通透性方面起着调节开关的作用。细胞炎症因子包括抗炎因子和促炎因子,机械力牵张可以导致炎症反应失衡,引起炎症反应。酪氨酸激酶是一种酶偶联型受体,在细胞质膜的表面分布,它分为受体酪氨酸激酶、胞质酪氨酸激酶和核内酪氨酸激酶三类。c-Src激酶属于胞质酪氨酸激酶家族,细胞内外的多条信号转导通路都通过c-Src激酶,包括细胞的生长、分化、转录等许多重要的生理过程。本课题组前期研究证明,c-Src激酶参与VILI。核转录因子kappaB(NF-κB)是细胞中重要的转录调节因子,其通过多种细胞因子参与机体的炎症反应。NF-κB活化受多种物质刺激激活,包括促炎因子、整合素、损伤DNA的化学物质、机械力等,他们与细胞表面或细胞内的受体结合,引起信号转导,活化NF-κB信号通路,参与细胞的炎症反应。谷氨酰胺是谷氨酸的酰胺,是哺乳动物体内非必需氨基酸,可由葡萄糖转变而来,是细胞增殖的重要能量来源,在骨骼、肌肉、肺脏、肝脏、脑组织等中可以被发现。谷氨酰胺研究表明,谷氨酰胺具有免疫调节作用,可以降低在氧化应激作用下的TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子的释放,减轻肺损伤,进而改善急性呼吸窘迫综合症的预后。目前,谷氨酰胺在机械通气相关肺损伤方面的研究不多,谷氨酰胺对机械相关肺损伤的保护机制不清楚,谷氨酰胺能否通过c-Src激酶调控细胞屏障功能,能否通过NF-κB信号通路调节细胞的炎症反应,是本课题研究的主要任务。第一部分机械力对炎症因子、E-cadherin、p120-catenin表达的影响研究目的本研究从体内实验和体外实验两方面来模拟机械通气肺损伤,探讨机械力对促炎因子白介素-6(Interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、抗炎因子(白介素-10,Interleukin-10,IL-10)表达的影响以及p120连环蛋白、E钙黏素的表达的影响。研究方法体内实验:18只健康C57BL/6小鼠,体重25-30g,8-9周龄,采用随机数字表法随机分为3组,每组6只:对照组(C组),小潮气量组(L组),大潮气量组(H组)。对照组大鼠,气管切开后,不进行机械通气;L组、H组两组气管切开后,行机械通气,L组呼吸频率为120次/min,潮气量为7mL/kg,呼气末正压为5cmH20,H组呼吸频率为40次/min,潮气量为20mL/kg,呼气末正压为0cmH2O;两组共用的参数:吸呼比(I:E)为1:2,吸入氧浓度为21%,通气时间为4h。机械通气后,记录肺损伤评分;支气管肺泡灌洗后,进行细胞总数检测,中性粒细胞百分比检测,利用ELISA检测灌洗液中IL-6、TNF-α、IL-10的表达情况;右肺上叶迅速放入液氮中,冻存备Western Blotting检测E-cadherin、p120-catenin;右肺其他部分做HE染色;左肺部分用来测湿干重比(W/D)。体外实验:将单层培养的小鼠肺上皮细胞(MEL-12细胞),采用随机数字表法随机分为3组,对照组(sham组)、牵张幅度为8%的机械牵张组(8%CS组、牵张幅度为20%的机械牵张组(20%CS组)。sham组未进行周期性机械牵张;CS组以频率0.5HZ,牵张幅度为8%、20%进行周期性机械牵张MLE-12细胞,机械牵张的时间为4h;三组MLE-12细胞及周期性机械牵张后,部分细胞在冰上迅速进行蛋白裂解,提取总蛋白,用于Western Blotting检测E-cadherin、p120-catenin的表达情况;同时收集预处理及周期性机械牵张后的MLE-12细胞,利用ELISA和实时荧光定量PCR检测各处理组IL-6、TNF-α、IL-10的表达情况。实验结果体内实验:1、HE染色显示,小潮气量机械通气肺泡变化不明显,大潮气量机械通气肺泡充血严重,出血,肺泡壁增厚,肺透明膜形成。2、肺损伤评分显示,与C组小鼠比较,H组小鼠肺损伤评分增加(P<0.05),与L组比较,H组小鼠肺损伤评分增加(P<0.05);3、湿干重比显示,与C组小鼠比较,H组小鼠湿干重比增加(P<0.05),与L组比较,H组小鼠湿干重比增加(P<0.05);4、肺泡灌洗液显示,与C组比较,H组肺泡灌洗液中的细胞总数、中性粒细胞、IL-6、TNF-α均增加(P<0.05),肺泡灌洗液中IL-10表达下降(P<0.05);与L组比较,H组肺泡灌洗液中的细胞总数、中性粒细胞、IL-6、TNF-α均增加(P<0.05),肺泡灌洗液中IL-10表达下降(P
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