关键词：核酸适配体;;头孢喹肟;;传感器;;抗生物残留;;检测
摘 要：头孢喹肟(Cefquinome)是动物专用的第四代头孢菌素类抗生素。目前已经在我国注册准许兽用,临床上主要用于治疗大肠杆菌引起的牛乳房炎,猪呼吸道等感染性疾病。一般情况下,奶牛用药不当或不遵守弃奶期会导致抗生素残留,给人们的食品安全带来极其严重的后果。欧盟和中国规定牛奶中头孢喹肟的最大残留量不超过20 μg/kg。然而,目前抗生素残留检测手段大多费时、费力、灵敏度较低,不能满足现场快速检测的要求。因此,建立牛奶中头孢喹肟残留的高灵敏检测方法尤为重要。核酸适配体(aptamer)是通过基于系统进化的体外指数配体富集技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment SELEX)筛选获得一段能够与靶分子特异性结合的寡核苷酸片段。由于具有靶标分子范围广、亲和力强、易修饰等优于传统抗体的优点,核酸适配体在生物分析、检测、食品安全、环境监测以及临床诊断与治疗等方面表现出巨大的应用潜力。本文通过基于磁分离的SELEX技术(Mag-SELEX)在体外首次筛选得到了四条能够与头孢喹肟特异性结合的单链DNA核酸适配体。然后,在此基础上构建了一种高特异性、高灵敏度的荧光核酸适配体生物传感器,用于定量检测牛奶样品中头孢喹肟的残留。具体内容如下:1、利用Mag-SELEX经过12轮筛选,得到了 4条可与头孢喹肟特异结合的DNA核酸适配体(分别为W1、W2、W3和W4)。这4条核酸适配体对头孢喹肟都具有较好的特异性和亲和力。其中,核酸适配体W1的特异性优于其他三条,亲和力也最强,其Kd值为40.13± 22.11 nM。2、利用核酸适配体W1,成功建立了 一种检测牛奶样品中头孢喹肟残留的荧光核酸适配体传感器,并对检测条件进行了系统性的优化。确定最佳探针长度为17bp,核酸适配体的最佳浓度为2 μM,双链DNA和链霉亲和素磁珠结合的最佳时间为1 h,最佳反应时间为30 min。该核酸适配体传感器特异性好、灵敏度高,线性检测范围为0.5-150 ng/mL,最低检测限为0.09 ng/mL,其对牛奶样品中头孢喹肟残留检测回收率介于96.6%-102%。
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