关键词：组织工程角膜基质;;角膜基质细胞;;胶原支架;;机械力;;移植;;有序排列
摘 要：目的:构建载有细胞的正交多层有序排列组织工程角膜基质,检测其特征和活性,探索机械力压缩及拉伸含角膜基质细胞的胶原及多层叠加手段,构建与自然角膜接近的仿生组织工程角膜基质并进行动物移植,探明构建的组织工程角膜基质形态学及分子生物学变化规律。方法:以原代提取的,体外扩增至第五代的新西兰白兔角膜基质细胞(CSCs)作为组织工程角膜基质构建的种子细胞。利用塑压胶原和拉伸胶原的技术,构建载有细胞的正交排列的4层压缩胶原(CC)和拉伸压缩胶原(SCC),并用谷氨酰胺转氨酶对其进行交联。然后CC和SCC进行7天的体外培养,进行透光度和机械强度试验。通过扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)检测CC和SCC的表面和内部超微结构。利用活死细胞双染试剂盒检测细胞在CC和SCC中的存活率。通过荧光染色测量细胞的排列和长度。通过共聚焦显微镜检测细胞的空间排列结构。WB和qPCR检测CC、SCC和平板培养(TCP)中细胞的基因表达变化。RNA-seq检测全转录组的表达差异,根据差异表达基因(DEGs)推测分子和通路的变化。最后通过兔角膜基质移植实验检测组织工程角膜基质的生物相容性和活性。结果:水化的CC、水化的SCC以及天然角膜基质的平均透光率分别为63.7%、73.8%和76.5%,脱水的CC、SCC和天然角膜基质平均透光率分别为87.7%、89.7%和98.5%。脱水的CC和脱水的SCC的拉伸强度分别为12.86±1.77 MPa和17.38±1.06 MPa。CC和SCC中CSCs的存活率分别为(83.5±3.7)%和(80.3±2.6)%,细胞长度分别为108.0±28.4μm和133.2±36.1μm。CC中的细胞为无序排列,SCC中的细胞为有序排列,分布在±30°之间。SEM和TEM显示,CC中胶原纤维呈无序排列,而SCC中胶原纤维呈有序排列。共聚焦显微镜结果显示,SCC中细胞呈多层正交排列,CC中细胞为无序排列。WB和qPCR结果显示,与TCP组相比,CD34、lumican在CC和SCC中上调,I型胶原、α-SMA和β-actin下调。ACTA2、COL1A1、FN1、VIM、MKI67、SNAI1、G0S2显著性下调,LUM和DCN显著性上调。流式结果显示,CC、SCC和TCP中细胞在G0/G1期的比例分别为56.0±2.9%、55.7±1.9%和49.9±1.4%,在S期的比例分别为24.9±0.3%、24.5±1.4%和34.8±2.3%,在G2/M期的比例分别为18.6±2.8%、19.5±0.5%和15.2±0.9%。CC和SCC在G0/G1和G2/M期的比例显著提升,在S期的比例显著下调。RNA-seq结果显示,以TCP作为对照组,CC中有2440个基因下调,2324个基因上调;SCC中有2445个基因下调,2346个基因上调。以CC作为对照组,SCC中有58个基因下调,55个基因上调。细胞分裂和DNA复制相关信号通路下调,FoxO、PI3K-Akt、axon guidance、MAPK等信号通路显著性上调。细胞骨架、胶原、激活、增殖等相关基因下调,基质金属蛋白酶和间隙连接相关基因上调。体内研究表明,CC和SCC在移植入兔角膜基质6周后,透明度越来越高。CC和SCC中有细胞,对照组无细胞进入。且CC和SCC中细胞能正常表达CD34和vimentin,不表达α-SMA,CC与SCC和组织相容性较好。结论:通过机械力压缩及拉伸含角膜基质细胞的胶原,制作了仿生组织工程角膜基质层,其具有多层有序正交排列、安静型基质细胞和良好的生物相容性。不仅为今后的角膜和其他组织工程器官的设计提供了基础和思路,而且提供了角膜和其他结缔组织发育、生长、重塑、再生和纤维化病理相关有价值的新见解。
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