关键词：间歇低载荷机械振动;;Wnt/β-catenin信号通路;;Runx2因;;成骨细胞;;DKK1
摘 要：研究背景和目的:骨骼在人体起着支撑身体的作用,随着人们生活水平的提高和医疗水平的发展,人均寿命普遍延长,骨质疏松症和各种原因导致骨折的患者也逐年增多。对于一些重大车祸、手术导致的骨折延迟愈合和骨折不愈合是困扰骨科医生的一个重要课题。有研究表明老年骨折中骨质疏松导致骨折的概率为69.4%。临床上对骨质疏松及骨折的治疗大多是使用药物和手术治疗,虽然具有一定的疗效,但是也带来的很多副作用。近年来研究发现适当的应力刺激可以促进骨形成,但是不同的应力刺激强度及频率影响成骨的效果不同。近些年来有关实验研究证实持续与间歇低载荷机械振动(频率32-37Hz,加速度0.2-0.3g)可以促进骨的成长、促进骨折愈合,对抗骨质疏松。我们课题组已经在低载荷机械振动促进骨生长、对抗骨质疏松方面进行了多年的研究,本课题主要是在间歇低载荷机械振动加载条件下,从Wnt/β-catenin信号通路、通路的特异性阻断剂Dkk1、细胞骨架等方面对间歇低载荷振动促进MC3T3-E1细胞成骨机制做出研究。为今后临床工作中治疗骨质疏松及促进骨折愈合提供一种新的治疗思路和理论支持。实验方法:1、持续与间歇低载荷机械振动对MC3T3-E1细胞内Wnt/β-catenin信号通路、Runx2因子的调控方法:基础对照组(Control):空白对照组,每日加载振动。每日振动30min(SV0.5h):每日实施持续30min的振动加载。每日振动15min×2+30min间歇(IV0.5h):每日实施两次各15min的振动加载,期间间歇30min。采取RT-q PCR、Western blot方式检测细胞内β-catenin m RNA、Runx2 m RNA、β-catenin蛋白表达程度。2、持续与间歇低载荷机械振动作用下Wnt/β-catenin通路对MC3T3-E1成骨效应的调控方法:将实验分为以下四组,空白对照组(Control),每日实施两次各15min的振动加载,期间间歇30min组(IV0.5h)+DKK1(0.2mg/m L)组,DKK1(0.2mg/m L)处理组,每日实施两次各15min的振动加载,期间间歇30min组(IV0.5h)组。待细胞贴壁生长至70%左右,家阻断剂组每组加阻断剂DKK1(0.2mg/m L),不加阻断剂组加等量PBS液,放置于培养箱中培养48小时,然后加载振动组开始施加间歇低载荷机械振动,不加载振动无论组相同环境下但不施加间歇低载荷机械振动。结论:1、持续与间歇低载荷机械振动均可促进成细胞的成骨效应,且间歇低载荷机械振动促进效果更明显;2、间歇低载荷机械振动作用时细胞内β-catenin蛋白、Runx2基因及蛋白表达水平上调,说明间歇低载荷机械振动能够能够促进小鼠MC3T3E1细胞的成骨效应并激活Wnt/β-catenin信号通路;3、无论持续与间歇低载荷机械振动加载与否,特异性阻断剂Dkk1作用下,Wnt/β-catenin信号通路活性均被抑制,Runx2基因及蛋白表达水平下降,证明了间歇低载荷机械振动上调Runx2基因来促进成骨效应时Wnt/β-catenin信号通路参与了促进作用。
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