695.纺织纤维集合体微纳结构对内皮细胞黏附及其生长的调控机制研究
[纺织业] [2019-10-20]
当人体自身的组织、器官因外伤或者疾病而产生损伤和功能性丧失时,会对人类的健康及生命安全产生严重的威胁。病变组织和器官的及时修复以及功能恢复则成为治疗疾病的重要环节。在现有的医学认知条件下,根据病变部位的损伤程度对受损部位进行修补,或者借助自体、异体移植以及人工器官对其进行置换和重建,或许是最好的解决办法。然而,目前仍有许多重大科学问题亟待解决,这些问题可以归纳为以下两方面。其一,自愿捐献的供体器官数量明显不足,难以满足临床需求;其二,通过人工手段开发的人工组织、器官与人体组织的同源性差、结构差异大,很难兼具良好的生物相容性和机械性能。因此,最大限度地提高人工生物材料的生物相容性并缩短生物材料的开发周期,是提高人工组织、器官临床应用成功的必要环节和重要保障。目前,对生物材料的生物相容性评价多采用体外评价和体内评价。体外评价以通过体外建立的细胞学实验为基础,对材料与细胞或血液的相容性进行评价;体内评价是直接将材料植入实验动物体内对材料与组织是否相容进行评价。相较于动物体内实验,体外评价更为方便、快捷,可以节约大量的时间、金钱和人力,已广泛用于纺织生物材料的设计及性能预估。但是,目前的体外评价手段具有一定的局限性。首先,定性分析需要通过定量分析来佐证;其次,这两种方法均存在一个致命的缺陷,即难以揭示细胞生长的内在因素及调控机制。因此,在体外评价体系中,引入一个既能反映细胞生长状态,又能揭示影响细胞生长的机制的合适的指标和合理的方法,具有重要意义。针对目前生物相容性体外评价所存在的缺陷,本课题以纤维集合体微纳结构对细胞黏附的影响为切入点,围绕以下四个方面进行研究。(1)引入细胞间粘附分子-1(Intercellular cell adhesion molecular-1,ICAM-1)作为评价指标,揭示材料结构与细胞黏附之间的调控机制。通过选用不同孔径的筛网以控制发泡剂的尺寸,制备孔径分布为0-38μm、38-75μm、75-100μm的PCL多孔膜,测定其水接触角,评价不同孔径分布对材料亲疏水性的影响。随之,将材料与人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC)进行共同培养,分别使用免疫荧光、免疫酶标技术(ELISA)检测孔径大小及其分布是否影响细胞膜表面胞间粘附分子(Membrane ICAM-1,mICAM-1)、可溶性粘附分子(SolubleICAM-1,sICAM-1)的表达,分析不同孔径分布的材料表面,细胞表达mICAM-1与sICAM-1之间的关系,探究其作为新的指标评价细胞在材料表面黏附状态的可行性、可靠性及准确性。(2)通过均质微孔机织平纹结构的构建,深入研究不同微米级孔径结构与细胞生长特性的构效关系并选择最优结构。选取30 D涤纶单丝和复丝作为基础材料,选取30 D涤纶单丝为经纱,控制经纱密度为850根/10厘米不变,选用30 D的涤纶单丝或复丝作为纬纱并改变纬纱密度(单丝600、700和800根/10厘米,复丝500、600和700根/10厘米),织造具有不同微米级孔径尺寸的涤纶平纹机织结构;表征材料表面的孔隙率、紧度和亲疏水性;通过CCK-8、扫描电镜、激光共聚焦显微镜、ICAM-1表达评价其对细胞细胞生长特性的影响,优选最适宜细胞黏附和增殖的机织结构及相应的微米级孔径。(3)探究机织结构由低温等离子刻蚀处理形成表面具有纳米沟槽的拓扑结构,研究其表面纳米结构变化对细胞糖组的影响。选用氩气,在20 Pa的真空度下处理5min,改变刻蚀功率(150 W、200 W、250 W和300 W),对涤纶平纹织物进行低温等离子体刻蚀,在单丝表面构建了四种不同的纳米级沟槽结构。使用CCK-8、扫描电镜、激光共聚焦显微镜,检测黏附在材料表面的细胞活性和生长状态,免疫荧光、ELISA法检测细胞mICAM-1及sICAM-1的表达水平,评价机织结构表面的纳米级拓扑结构对细胞相容性的影响;并将最新的细胞O-糖链扩增技术(Cellular O-Glycome Reporter/Amplification,CORA)、蛋白质印迹法(WesternBlot)、胶内酶解以及质谱分析引入生物材料的细胞相容性评价体系,通过材料微纳结构对N-聚糖和O-聚糖表达的影响,即细胞糖组变化揭示其对细胞生长的调控机制。(4)初步探索在不同流速下,内皮细胞在不同微纳结构表面的黏附力强弱,以及在动态培养条件下细胞在材料表面黏附力与流体剪切力之间的关系。利用体外循环培养系统,通过控制体系内流体的流速(1 m/s,2 m/s和3 m/s),检测并分析流体对材料表面黏附细胞进行冲刷后,单位面积材料表面剩余黏附细胞与流体剪切力的关系。实验结果表明:(1)在一定范围内(0-100 μm),PCL多孔膜表面亲水性随孔径增大而提高。同时,随多孔膜表面孔径增大,I型胶原在材料表面的单位面积黏附量也相应增加;孔径分布不但影响材料表面的亲疏水性,也影响细胞外基质在材料表面的黏附以及细胞在材料表面的黏附和增殖。人脐静脉内皮细胞在微孔直径为0-38 μm的PCL膜表面生长7天可形成单细胞内皮层,在直径为38-75 μm的PCL膜表面细胞覆盖面积为60%,在直径75-100 μm的PCL膜表面细胞覆盖面积为80%。ICAM-I表达水平,可以作为评价细胞与材料黏附及材料生物相容性的一个重要指标;mICAM-1升高细胞在材料表面的黏附及增殖能力较强;sICAM-1升高细胞在材料表面的黏附及增殖能力受抑。(2)控制经纱种类为单丝并保持经纱密度不变,仅改变纬纱密度及选用单丝或复丝作为纬纱,成功构建了六种具有不同孔隙率和紧度的机织平纹结构,其水接触角均在30°-45°以内,化学结构无明显差异。当纬纱为单丝时,随纬纱密度增加,亲水性提高;当纬纱为复丝时,随纬纱密度增加,亲水性减弱;细胞在纬纱为复丝的表面黏附情况优于单丝,这是因为复丝表面存在天然的平行沟槽结构,且组织点处的复丝表面较为平整,细胞可以附着的位点较多。细胞在机织微孔材料表面的初始黏附多集中在组织点处,组织点处孔径尺寸越小,mICAM-1水平越高,sICAM-1浓度越低。设计密度为经密(单纱)×纬密(复丝)为850×700根/10厘米的结构,其孔径尺寸小于20 μm时有助于细胞在材料表面内皮化进程,确定为本实验最优结构。(3)选用氩气等离子体对优选后的机织涤纶平纹材料(A:850×700根/10厘米)进行刻蚀,经过等离子体刻蚀后,在材料C(200 W)、D(250 W)和E(300 W)表面均出现了相对明显的沟槽结构,沟槽宽度分别为 294.20 ± 0.08 nm、523.63 ± 0.14 nm 和 785.07 ± 0.21 nm,而在材料B表面的单丝上,仅发现少量不规则的细纹,说明沟槽的存在对于该种O-聚糖结构的表达起到了一定的促进作用。与未处理前相比,具有微纳沟槽结构的材料表面细胞sICAM-1的水平明显降低,有助于细胞黏附。与空白对照相比,未经等离子体处理的材料表面细胞 Core1(955、1003Da)、Core2(1317、1404、1766Da)结构的表达均有降低,N-聚糖结构未见明显改变。等离子体处理不能影响材料表面细胞N-聚糖表达,但可不同程度地影响材料表面细胞O-聚糖表达;B表面的细纹结构只能升高细胞Core1(1003 Da)及Core2(1404Da)结构表达水平;具有微纳沟槽结构表面的C、D和E材料可使Core 1及Core 2结构增高。(4)体外动态培养实验结果表明,等离子体刻蚀构建的微纳沟槽结构可增强细胞在材料表面的黏附力。当材料用于制作人工血管时,可根据血管壁所受剪切力,依据不同剪切力作用下,材料表面剩余黏附细胞数量来选择合适的材料。根据不同等离子体刻蚀功率将实验材料编号为 A(150W)、B(200W)、C(250W)、D(300W)和 E(未处理试样),当剪切力5.4dyn(体外培养流速为1m/s)部位的选材顺序为D>B=C>A=E,剪切力为7.0dyn(体外培养流速为2m/s)部位的选材顺序为D>A>C=B>E,而剪切力为11.2dyn(体外培养流速为3m/s)部位的选材顺序为D=A>B>C=E。综上所述,本研究通过构建具有不同微纳拓扑结构的机织平纹表面,不仅证实了微纳拓扑结构可影响细胞黏附,而且成功地将粘附分子引入材料生物相容性的评价体系;并首次通过探究材料结构对黏附细胞表面糖组结构表达的影响,揭示了材料影响内皮细胞黏附的根本原因。在此基础上,借助体外动态培养,探究了不同流体剪切力对材料表面黏附细胞的影响,进一步完善了体外生物相容性评价体系,为材料的结构设计及生物相容性评价奠定了坚实的基础。
关键词：纤维集合体;;微纳结构;;糖基化;;生物相容性;;粘附分子;;动态培养
027-87841330