关键词：神经病理性疼痛(NP);;钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ);;一氧化氮(NO);;蛋白质巯基亚硝基化(S-nitrosylation);;质谱分析
摘 要：目的:神经病理性疼痛(Neuropathic pain,NP)是指“由躯体感觉神经系统的损伤或疾病而直接造成的疼痛”,其产生原因多样,产生机制复杂。NP不同于组织损伤所致的急性疼痛,其疼痛程度重、病程长,现有的治疗方法和药物均无良好的疗效,因此关于其发病机制的研究一直是疼痛研究者的重要任务。目前认为脊髓的中枢敏化为NP产生的重要原因,其中钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca~(2+)/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ)在中枢敏化中的作用受到广泛关注,如何抑制CaMKⅡ的活性是研究的重点。一氧化氮(nitricoxide,NO)作为一种重要的信使分子通过两种途径参与了神经病理性疼痛的发病过程:经典的NO/可溶性鸟苷酸环化酶(guanylate cyclase,sGC)-环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)-蛋白激酶G(protein kinase G,PKG)(NO/sGC-cGMP-PKG)途径和蛋白质巯基亚硝基化(S-nitrosylation)途径。本实验的目的便是探讨在神经病理性疼痛发病过程中,NO是否会通过亚硝基化反应调节CaMKⅡ的内在活性,进而对动物疼痛学行为产生的影响。研究方法:所有实验动物(雄性SD大鼠共104只)随机分为15组,分别为非手术组(Naive)(n=4)、假手术组(Sham)(n=24)、SNⅠ手术后1天组(D1)(n=4)、SNⅠ手术后4天组(D4)(n=4)、SNⅠ手术后7天组(D7)(n=4)、SNⅠ手术后10天组(D10)(n=4)、SNⅠ手术后14天组(D14)(n=4)、DMSO+SNⅠ手术组(DMSO)(鞘内给药:10ul/rat,n=20)、KN93+SNⅠ手术组(KN93)(30uM/10ul/rat,n=4)、tatCN21+SNⅠ手术组(CN21)(20uM/10ul/rat,n=4)、L-NAME+SNⅠ手术组(L-NAME)(50ug/10ul/rat,n=4)、1400W+SNⅠ手术组(1400W)(30ug/10ul/rat,n=4)、7-NI+SNⅠ手术组(7-NI)(30ug/10ul/rat,n=4)、GSNO+SNⅠ手术组(GSNO)(50ug/10ul/rat,n=12)、ODQ+GSNO+SNⅠ手术组(ODQ+GSNO)(20ug/5ul+50ug/5ul/rat,n=4)。所有实验动物手术前均需采集下肢缩爪阈值(paw withdrawal threshold,PWT)。需要手术的实验鼠预先制作鞘内置管模型,大鼠恢复7天之后制作坐骨神经分支损伤(Spared nerve injury,SNⅠ)模型。术后每日均采集PWT,于术后第7天开始进行鞘内给药,连续给药4天至术后第10天。在各个对应时间点检测脊髓中CaMKⅡ第286位苏氨酸自磷酸化水平(CaMKⅡ-T286)、AMPA受体(α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体,AMPAR)的GluA1亚基第831位丝氨酸磷酸化水平(GluA1-S831)、CaMKⅡ亚硝基化水平(S-Ca MKⅡ)。其中SHAM、DMSO、GSNO组在给药结束后尚检测了CaMKⅡ发生亚硝基化的位点,并进行了比较。结果:第一部分:应用KN93和tatCN21并结合动物疼痛学行为表现(PWT)来验证CaMKⅡ的内在活性是否由CaMKⅡ-T286来反应,是否有其他机制参与其活性的调节。通过对结果的统计分析我们得出以下结论:PWT的变化显示,鞘内注射KN93和tatCN21均能明显抑制大鼠的机械痛敏,其中tatCN21作用更强(图1A,p<0.05);tatCN21对GluA1-S831的降低作用与动物疼痛学行为一致,比KN93作用强(图1B、C,p<0.05);tatCN21对CaMKⅡ-T286抑制程度反而没有KN93强(图1B、D,p<0.01);GluA1-S831磷酸化水平呈现出与动物疼痛程度基本相同的趋势,在第7天达到高峰之后开始缓慢下降(图2B、C);S-CaMKⅡ亚硝基化与动物的疼痛学行为最一致,在第10天达到顶峰之后开始下降(图2B、E);CaMKⅡ自磷酸化水平在第7天迅速上升,此后一致处在很高的水平,并未有下降趋势(图2B、D)。这说明,GluA1-S831与S-CaMKⅡ能够反映动物的机械痛敏程度,S-CaMKⅡ比CaMKⅡ-T286更好地反映CaMKⅡ的内在活性。第三部分:观察不同的NOS抑制剂对PWT的影响,判断S-CaMKⅡ主要由哪种NOS抑制剂来介导。结果显示:三种抑制剂均不同程度地减轻了动物的机械痛敏,其中非选择性抑制剂L-NAME镇痛作用最强,nNOS抑制剂7-NI作用最弱,iNOS选择性抑制剂1400W居中(图3A,p<0.01);伴随着NOS抑制剂对组织内NO含量的明显抑制(图3B,p<0.01),S-CaMKⅡ明显下调(图3C、F,p<0.01),与GluA1-S831的下调相一致(图3C、D,p<0.05);CaMKⅡ-T286与疼痛学行为以及GluA1-S831变化无相关性(图3C、E)。这说明,三种NOS均参与了S-CaMKⅡ的调节,且S-CaMKⅡ能够比CaMKⅡ-T286更准确的反应CaMKⅡ的内在活性。第四部分:验证外源性的NO是否通过影响S-CaMKⅡ参与神经病理性疼痛的发生过程。结果显示:GSNO能够显著增加痛敏,且这种致痛作用不能够被鸟苷酸环化酶抑制剂,ODQ所废止(图4A,p<0.05);GSNO的致痛作用伴随着S-CaMKⅡ表达的大幅增加(图4B、E,p
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