关键词：骨质疏松;;骨细胞;;破骨细胞;;脉冲电磁场;;机械振动;;初级纤毛
摘 要：骨质疏松症是一种常见的全身代谢性骨病,主要特征为骨密度降低,骨量低下,骨微结构损坏,可以导致骨脆性增加以及骨折风险的显著提升。随着我国人口老龄化问题的日益严重,骨质疏松给社会造成的经济负担问题逐渐凸显。然而,目前的骨质疏松药物存在昂贵、疗效较差或是副作用比较大等各种问题。脉冲电磁场(PEMF)及机械振动被认为是两种非侵入式的价格低廉且安全有效的骨质疏松的物理治疗方法已经在临床上得到认证,然而其具体的作用机制及最优参数选择仍然不明确。本研究通过对骨骼内的两种关键细胞—骨细胞及破骨细胞施加不同参数的两种物理因子,检测观察其行为及功能的变化,探究其中的调控机制。本研究的研究结果提示:(1)PEMF对骨细胞及破骨细胞的调控具有强度依赖性,5 G为PEMF作用于两种细胞以达到抑制破骨细胞骨吸收的最优参数;(2)机械振动对骨骼细胞的调控具有频率依赖性,70 Hz为作用于RAW264.7细胞抑制破骨细胞活性及骨吸收功能的最优参数,而50 Hz是机械振动作用于骨细胞然后抑制RAW264.7细胞生成的破骨细胞活性及骨吸收功能的最优参数;(3)骨细胞样MLO-Y4细胞可以通过分泌细胞因子RANKL及OPG对RAW264.7细胞向破骨细胞分化的过程进行调控,不同参数的两种物理因子可以对RANKL及OPG的分泌产生影响从而调控分化过程。(4)骨细胞样MLO-Y4细胞通过初级纤毛感应及介导外界PEMF刺激。第一部分:不同强度脉冲电磁场对破骨细胞的形成、凋亡及骨吸收能力的影响背景:PEMF在体内实验中可以增加骨量,骨质疏松动物的骨形成速率明显提高,同时在体外实验中也增强了成骨细胞活性和成骨细胞矿化能力。已经有文献报道了PEMF刺激具有促进成骨细胞生成能力,但是目前对于PEMF作用于破骨细胞时对破骨细胞活性和功能的调节作用及相关机制仍然缺乏足够的理解。方法:使用不同强度(0,5,10,20及30 G)的15 Hz的PEMF刺激RANKL诱导的RAW264.7细胞,通过鬼笔环肽染色检测形成的破骨细胞F-actin细胞骨架结构变化,通过TRAP染色观察生成的破骨细胞数目,通过SEM检测破骨细胞骨吸收能力,通过Annexin v-FITC/PI染色检测细胞凋亡,通过qRT-PCR对骨吸收及凋亡相关基因进行检测。结果:5 G时大部分形成的破骨细胞具有不成熟的破骨细胞F-actin细胞骨架结构,破骨细胞数目较少,骨吸收能力较差,而且细胞凋亡被抑制。随着强度的升高,细胞逐渐显示出成熟破骨细胞细胞骨架结构,破骨细胞数目增多,且凋亡的破骨细胞数目增加。此外,RANK,NFATc1,TRAP,CTSK,BAX和BAX/BCL-2的基因表达在5 G组显著降低,在30 G组明显增加。结论:PEMF可以直接作用于破骨细胞前体细胞,对破骨细胞的形成、凋亡及骨吸收能力的有调控作用,且具有强度依赖性,其中5 G可作为PEMF抗骨吸收功能的最优参数,主要通过抑制破骨细胞的形成和成熟而使骨吸收能力显著降低。第二部分:脉冲电磁场对骨细胞的影响及对破骨细胞活性的抑制依赖于初级纤毛背景:初级纤毛广泛存在于各种细胞表面,能感知细胞外机械和化学信号变化并协助其转导至细胞内部,从而引起细胞应答。本实验研究骨细胞对不同强度电磁场的响应,然后通过沉默MLO-Y4骨细胞构建初级纤毛必须的Polaris基因检测细胞响应是否依然存在,由此可以探索初级纤毛是否是骨细胞感应脉冲电磁场并做出反应的器官。方法:使用不同强度(0,5,30 G)的PEMF作用于MLO-Y4细胞,系统检测其对骨细胞增殖、凋亡、F-actin及相关基因表达水平的影响。使用不同组的骨细胞条件培养基培养RAW264.7细胞,观察其向破骨细胞分化的影响。通过CCK-8检测骨细胞增殖,通过Annexin v-FITC/PI及流式细胞仪检测骨细胞凋亡,通过鬼笔环肽染色检测细胞骨架结构变化,通过si RNA转染干扰骨细胞初级纤毛形成,通过TRAP染色观察破骨细胞数目,通过SEM及甲苯胺蓝染色检测破骨细胞骨吸收能力,通过ELISA检测分泌性RANKL及OPG的变化,通过qRT-PCR对RANKL/OPG通路及凋亡相关基因进行检测。结果:骨细胞凋亡和肌动蛋白细胞骨架结构受到PEMF刺激的强度依赖性调节。由PEMF刺激的骨细胞条件培养基诱导的破骨细胞的形成和骨吸收能力在受到5 G的PEMF刺激时被抑制。在受到PEMF刺激后,RANKL,BCL-2的表达水平及RANKL/OPG的比率均降低。当对骨细胞的初级纤毛进行干扰后,5 G的PEMF刺激后的MLO-Y4条件培养基对破骨细胞活性及骨吸收能力的抑制作用被减弱。结论:骨细胞可以感应PEMF刺激,并且细胞对PEMF的响应具有强度依赖性。5 G为PEMF刺激作用于骨细胞抑制骨吸收作用的最优参数。骨细胞的初级纤毛对其感受及介导PEMF刺激起着重要作用。第三部分:不同频率的振动应力对RAW264.7细胞的破骨细胞形成及骨吸收能力的影响背景:机械振动的抗骨丢失已经形成共识,但是其具体机制仍不清楚。而且,成骨效应是否只是就成骨细胞效应的结果,还是对体内的破骨细胞也有作用?因此,研究不同频率的振动对骨细胞活性、破骨细胞分化、骨吸收能力的影响能更好的阐述防治骨质疏松的机制。方法:本实验使用不同频率的机械振动(Control,30 Hz,50 Hz,70 Hz)直接作用于破骨细胞前体RAW264.7细胞,观察振动对破骨细胞分化、成熟、骨吸收功能的影响。通过鬼笔环肽染色检测细胞骨架结构变化,通过TRAP染色观察破骨细胞数目,通过甲苯胺蓝染色检测破骨细胞骨吸收能力,通过qRT-PCR对骨吸收能力及凋亡的相关基因进行检测。结果:受到不同频率机械振动刺激后,RAW264.7细胞生成的破骨细胞数目均减少,骨吸收能力减弱,F-actin细胞骨架结构改变,且50 Hz及70 Hz的细胞骨架结构变形较严重。不同频率下,MMP-9、TRAP、CTSK的表达均被抑制。受到30 Hz机械振动刺激后,BAX/BCL-2比值明显升高。结论:机械振动可以直接作用于RANKL诱导下的RAW264.7细胞,明显地抑制破骨细胞前体细胞向破骨细胞分化及其骨吸收功能,抑制作用的程度与频率的大小相关。随着频率的升高,机械振动对生成的破骨细胞数目及其骨吸收能力的抑制作用越明显。机械振动对于骨质疏松的治疗作用机制并不仅体现于对成骨细胞的调控,也与其对破骨细胞的调控紧密相关。第四部分:不同频率机械振动对骨细胞的影响及其对破骨细胞分化及骨吸收能力的调控背景:本实验旨在研究机械振动在骨骼中发挥抗吸收作用以此达到治疗骨质疏松作用的细胞机制及分子机制。方法:检测使用不同频率(0,30 Hz,50 Hz及70 Hz)的机械振动作用于MLO-Y4细胞后,检测细胞凋亡、F-actin细胞骨架结构及相关基因表达水平的变化;然后使用骨细胞的条件培养基对RAW264.7细胞进行培养,检测其向破骨细胞分化的能力的变化。通过Annexin v-FITC/PI及流式细胞仪检测细胞凋亡,通过鬼笔环肽染色检测F-actin细胞骨架结构变化,通过TRAP染色观察破骨细胞数目,通过甲苯胺蓝染色检测破骨细胞骨吸收能力,通过ELISA检测分泌性RANKL及OPG的变化,通过qRT-PCR对RANKL/OPG通路及凋亡相关基因进行检测。结果:MLO-Y4细胞受到不同频率的机械振动刺激后,细胞凋亡、RANKL/OPG比值、诱导形成的破骨细胞数目及骨吸收能力均减少,其中50 Hz时抑制作用最强。F-actin细胞骨架结构改变,其中70 Hz时变形严重,细胞核形变、细胞皱缩且细胞间突触连接网络被破坏。结论:机械振动可以抑制骨细胞的凋亡及RANKL/OPG比率,骨细胞通过分泌可溶性因子RANKL及OPG可以对RAW264.7细胞的破骨细胞分化及骨吸收作用进行调节,抑制破骨细胞活性。而50 Hz是作用于骨细胞后抑制破骨细胞活性最明显的频率参数。
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