关键词：机械应力;;腱骨愈合;;间充质干细胞;;肌腱细胞;;共培养;;周期性压力;;成骨细胞;;凋亡;;PI3K/Akt;;JNK;;周期性机械压力;;骨髓间充质干细胞;;成骨;;成脂;;分化
摘 要：第一部分机械拉力对腱骨愈合过程的影响以及对间充质干细胞和肌腱细胞共培养系统增殖与分化的调节作用【目的】探讨周期性机械拉力对白兔自体半腱肌腱重建前交叉韧带术后腱骨愈合的影响以及在体外模型中对骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)和肌腱细胞(tendon cells,TCs)共培养系统的增殖与分化的调节作用。【方法】建立新西兰白兔自体半腱肌腱重建前交叉韧带模型,术后行膝关节持续被动活动(continuous passive motion,CPM)治疗,在术后6周及12周时取材行组织学观察与评分、测试肌腱-骨复合物的抗拔出强度以及RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)法检测腱骨愈合界面相关细胞基质的表达,通过与对照组比较,评价CPM治疗对腱骨愈合的效果。体外实验中,分别分离培养BMSCs和TCs,将两种细胞以1:1比例直接接触共培养,并使用周期性机械拉力作用于此共培养系统,使用Alamar Blue法检测细胞增殖能力的变化以及RT-PCR法检测其相关基质的合成情况。【结果】前交叉韧带重建术后CPM治疗可以显著促进腱骨愈合,与对照组相比,治疗组的腱骨界面早期出现较多的纤维软骨组织,肌腱-骨复合组织块具有更高的抗拔出强度,腱骨界面的组织中表达更多的CollagenⅠ,alkaline phosphatase,osteopontin,Tenascin C和tenomodulin。另外,与对照组相比,机械拉力可明显促进BMSC/TC共培养系统的细胞率以及增强CollagenⅠ,CollagenⅢ,alkaline phosphatase,osteopontin,Tenascin C和tenomodulin的表达。【结论】机械应力可增强腱骨界面局部前体细胞如BMSCs和TCs的增殖和分化能力,从而促进腱骨愈合。第二部分周期性机械压力对成骨细胞凋亡的调节作用及其机制【目的】探讨周期性机械压力对大鼠成骨细胞凋亡的影响及其机制。【方法】使用周期下落的液滴产生的周期性压力作用于单层贴壁培养的大鼠成骨细胞,通过TUNEL染色和测定Caspase-3的活性来观察不同大小及频率的机械应力对细胞凋亡的效应;选取代表性强度的机械应力刺激成骨细胞,Western blot法测定细胞中MAPKs和PI3K/Akt信号通路中各信号蛋白的活化情况;使用特异性的阻断剂对上述两条信号通路中部分信号蛋白进行阻断,使用流式细胞仪检测高强度机械应力对成骨细胞促凋亡作用的改变情况;使用高强度机械应力刺激成骨细胞,分别阻断JNK和PI3K/Akt信号通路,使用Western blot法测定细胞中Bax/Bcl-2/Caspase-3的活化水平变化情况。【结果】机械刺激以强度依赖性方式调节成骨细胞凋亡,即较低强度的应力(0.15Hz×4cm,0.15Hz×8cm)可抑制细胞凋亡,较强的应力(0.6Hz×8cm)促进细胞的凋亡;应力可激活MAPKs和PI3K/Akt信号通路,随着应力强度的增加,ERK与Akt的磷酸化呈现先增强后减弱的趋势,而JNK与p38的磷酸化呈现不断增强的趋势;当使用较强的应力(0.6Hz×8cm)时,细胞凋亡明显增加(P<0.05),而阻断JNK通路可显著减少细胞凋亡(P
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