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基于数字图像技术的冬油菜氮素营养诊断
【目的】利用田间氮肥梯度试验探讨数字图像技术对冬油菜氮素营养无损评估预测的可行性,明确该技术的最佳数码参数和方程模型,为数字图像技术进行冬油菜氮素无损诊断提供依据。【方法】2013—2014年在湖北省武穴市开展不同施氮处理田间试验,以冬油菜为试验材料,设置不同氮素水平(0、90、180、270和360kg·hm-2),分别于六叶期、十叶期、蕾薹期和开花期,利用数码相机获取冠层数字图像数据,同时采集植株样品分析其生长特征值,研究其相关性并建立氮素营养参数的方程模型。利用2014—2015年独立氮肥水平试验,对上述方程模型拟合精度进行验证并绘制1﹕1线性关系图。【结果】数字图像红光值(R)、红光标准化值(NRI)和绿光与蓝光比值(G/B)与冬油菜氮营养状况常规诊断指标地上部生物量、叶片氮浓度和叶绿素浓度等呈负相关关系,而绿光值(G)、蓝光值(B)、绿光与红光比值(G/R)、蓝光与红光比值(B/R)、绿光标准化值(NGI)和蓝光标准化值(NBI)则与上述指标呈正相关关系,红光标准化值(NRI)与其他数码参数相比能更好地表征冬油菜的氮素营养状况,蕾薹期红光标准化值NRI与氮肥用量、地上部生物量、叶片氮浓度、叶绿素浓度、氮素吸收量和氮营养指数之间的关系可分别用线性方程y(t·hm-2)=-8.003x+2.706、y(t·hm-2)=-106.072x+38.200、y(g·kg-1)=-692.99x+261.84、y(mg·g-1)=-12.750x+5.665、y(kg·hm-2)=-4087.416x+1414.274和y=-27.198x+9.812来表达,其相关性达到极显著水平。2014—2015年独立试验模型检验结果表明,叶片氮浓度、叶绿素浓度和氮营养指数实测值与预测值的决定系数R 2分别为0.917**、0.746**和0.953**;均方根误差RMSE分别为0.821、0.330和0.228;相对误差RE%分别为26.32%、28.57%和28.39%,模型预测精度较好。【结论】数字图像技术可以用于冬油菜氮素营养的评估预测,评估时期为蕾薹期(包括)之前均可,最佳预测参数为红光标准化值NRI,参数的最佳方程模型为直线方程函数。
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棉花花粉中高效转录U6启动子的克隆及功能分析
【目的】以棉花品种新海16基因组DNA为模板,克隆海岛棉(Gossypium barbadense L.)Gb U6启动子,筛选出能在棉花生殖细胞中(花粉)高效转录的Gb U6启动子,为利用基因组编辑技术进行棉花分子育种奠定重要基础。【方法】采用两轮PCR方法克隆完整的Gb U6启动子。根据网上公布的棉花基因组数据库序列,利用Primer5.0软件设计5对引物,进行第一轮能覆盖完整Gb U6启动子的PCR扩增,产物克隆测序正确后,再利用transfer PCR法将Gb U6启动子精确亚克隆到CRISPR/Cas9基因组编辑载体中;第二轮扩增产物测序正确后,运用DNAMAN软件对克隆成功的5个Gb U6启动子序列中具有转录功能的必要元件进行分析;然后以p BI101质粒DNA为模板,PCR扩增并克隆GUS报告基因,经酶切鉴定、测序正确后,用BbsⅠ酶切GUS,连入经同样酶切后的5个Gb U6启动子对应的CRISPR/Cas9基因组编辑载体中,转化、酶切鉴定,获得对应的5种Gb U6::GUS的表达载体。将含有Ca MV35S启动子驱动的GUS表达载体作为棉花花粉瞬时转化的阳性对照,以上述6种表达载体DNA为模板,采用高保真酶的PCR扩增法获得高浓度DNA片段,利用基因枪轰击法将5种Gb U6::GUS和阳性对照的DNA片段分别转化棉花花粉,并进行GUS染色,最后用体式显微镜观察染色情况。每个启动子的基因枪转化重复3次,最后根据染色深浅筛选出在棉花生殖细胞中高效转录的Gb U6启动子。【结果】经两轮PCR扩增后获得5种Gb U6启动子,启动子长度分别为1 166、1 119、1 134、1 214和1 176 bp,并构建获得了相应的5种CRISPR/Cas9基因组编辑载体;对拟南芥和克隆的5个Gb U6启动子序列进行序列比对,结果表明,Gb U6启动子区与拟南芥U6启动子一样,也含有比较保守的-60 bp位置的USE元件和-30 bp位置的TATA框,而且这两个元件之间的距离也非常固定;用Gb U6::GUS的DNA片段瞬时转化棉花花粉,发现基因枪瞬时转化的3次重复结果显示克隆得到的5个Gb U6启动子有4个能驱动GUS在棉花花粉中表达,棉花花粉被染成蓝色。其中Gb U6-5P::GUS的染色相对较深,接近于Ca MV35S启动子。【结论】成功克隆了棉花生殖细胞中高效转录的Gb U6启动子,为构建棉花CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统提供了有效的启动子。
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中美大豆Ⅲ熟期组代表品种根系形态和活力的比较研究
【目的】研究中美大豆【Glycine max(L.)Merr.】Ⅲ熟期组不同年代育成代表性品种根系的形态和活力,及其对施肥水平的响应,试图揭示大豆品种根系性状随产量改良的演变趋势。【方法】以祖先亲本相同(均来自Williams和Amsoy),分别在中国辽宁省和美国俄亥俄州(相同纬度)育种程序下育成的代表性品种为试材,于2012和2013年盆栽条件下,采用随机区组试验设计,在大豆幼苗期(V2)将磷酸二铵水溶后均匀施入盆中,施肥量设3个水平,分别为0、150 mg·kg-1干土、300 mg·kg-1干土。在大豆苗期(V4)、开花期(R2)、鼓粒中期(R6)和鼓粒末期(R7)取样,于植株子叶节处剪断,套上内置脱脂棉的离心管,利用吸液差重法测定根系伤流量;用Epson Expression 10000XL仪扫描洗净的根系,使用Win Rhizo2012软件分析扫描图像,测定根系总长度、根系总表面积和根毛数量;采用氯化三苯基四氮唑法(TTC法)测定根系活力;将扫描完毕的根系在105℃下杀青30 min,80℃下烘干至恒重,测定根系干重;在成熟期测定单株籽粒产量。【结果】随着大豆品种产量的遗传改良,俄亥俄品种和辽宁品种的根系总长度、根系总表面积、根毛数量、根干重、根系伤流量和根系活力的改良趋势一致,均随产量的改良呈递增趋势,特别是在鼓粒中期和鼓粒末期,根系形态和活力等指标随育成年代增加而增幅较大。相同年代品种相比,俄亥俄品种根系总长度、根系总表面积、根毛数量、根系伤流量和根系活力的改良程度大于辽宁品种。随着施肥水平增加,俄亥俄当代品种和辽宁当代品种在中肥(150 mg·kg-1干土)和高肥(300mg·kg-1干土)水平下根系性状值均表现较高,而俄亥俄中期品种和辽宁中期品种在中肥水平下表现最佳。在相同施肥水平下,当代品种根系形态和活力等指标大于共同亲本和中期品种。相关和通径分析表明,苗期、开花期、鼓粒中期、鼓粒末期根系总长度、根系总表面积、根毛数量、根干重、根系伤流量、根系活力均与单株籽粒产量呈极显著正相关,其中根系活力与单株籽粒产量相关性最为密切。【结论】在大豆品种产量改良过程中,俄亥俄品种和辽宁品种根系形态和活力等指标的改良趋势相同,其根系总长度、根系总表面积、根毛数量、根系伤流量和根系活力均随产量改良呈递增趋势,但俄亥俄品种的改良程度大于辽宁品种。俄亥俄品种和辽宁品种根系的耐肥性均得到增强,两地区当代品种的根系性状值在中肥和高肥条件下均表现较高,而中期品种在中肥水平下表现最好。